[發明專利]一種提取純化Taq DNA聚合酶的方法

有效

• 申請號: 201410180380.1
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103966183A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 魏劭;林家旺;魏超
• 申請（專利權）人: 廈門安普利生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 方惠春

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提取純化Taq DNA聚合酶的方法。

背景技術

Taq DNA聚合酶為從Thermus aquaticus菌中分離出的大小約94kDa的一種熱穩定性聚合酶。未經修飾的Taq酶能在74℃時復制DNA，在鎂離子存在的情況下該酶催化核苷酸5′→3′的聚合反應成為雙鏈DNA，同時也具有5′→3′的外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于PCR和較高溫度條件下的引物延伸反應。高比活性的Taq DNA聚合酶特別適合應用于qPCR試劑盒的開發和一步法qRT-PCR試劑盒的開發。

目前，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件下進行（冰上操作），常規純化Taq DNA聚合酶方法采用低溫超聲破碎，（70-75）℃水浴孵化，反復通過硫酸銨沉淀、離子交換、層析和脫鹽進行純化，不僅高達50%的蛋白會在純化初期就會損失，部分基因組蛋白很難完全去除，再加上基因組蛋白的存在會導致上柱速度緩慢，延長純化時間，純化得到的蛋白酶活降低，影響了后期酶的聚合酶活性和外切酶活性，不利于qPCR試劑盒的開發應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單，酶活性損失小，回收蛋白的純度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。

為實現上述目的， 本發明提供一種提取純化Taq DNA聚合酶的方法，其步驟為，

1）工程菌的活化和表達：取Taq DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃，200rpm振蕩培養過夜；取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，振蕩培養后加入IPTG誘導培養8小時；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，離心；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌；

2）粗蛋白制備：將所述表達的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，再加入吐溫-20，冰上處理一段時間，15000g/4℃/20分鐘，得到的上清即為粗蛋白；

3）粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀；

4）上清液補足NaCl后流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，該柱先用10倍床體積結合緩沖液平衡；所述結合緩沖液為20mM Tris-HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌，所述洗滌緩沖液為20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，50mM咪唑；最后用洗脫液洗脫目的蛋白，所述洗脫液為20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脫液；含目的蛋白的洗脫液用sephadexG25脫鹽，脫鹽緩沖液為緩沖液B： 10mM Tris-HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脫鹽后即得到純化的Taq DNA聚合酶；

任選的，得到的Taq DNA聚合酶加入甘油使體積分數為50%，-20℃保存。

所述Taq DNA聚合酶工程菌為從水生棲熱菌yT1中PCR擴增得到PCR產物，所得PCR產物經NdeⅠ、SalⅠ雙酶切后克隆入經NdeⅠ、SalⅠ雙酶切的PET28a載體上，構建表達載體PET28a-taq，將上述質粒轉化表達菌BL21(DE3)，即獲得生產重組Taq DNA聚合酶的工程菌株。

所述PCR擴增所用的引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

所述步驟1）為取Taq DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃，200rpm振蕩培養過夜；取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，37℃，250 轉/分振蕩培養4小時后加入1M IPTG至終濃度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培養8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；12000rpm,4℃離心5分鐘收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，12000rpm，4℃離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌；所述緩沖液A為20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0。

所述步驟2）為將所述表達的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為1mM，加入吐溫-20使體積百分比為0.5%，冰上處理45分鐘，15000g/4℃/20分鐘，得到的上清即為粗蛋白。

所述步驟3）為粗蛋白中緩慢加入體積系數5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘，15000g，4℃離心20分鐘，去除沉淀。

所述步驟4）為上清液補足NaCl至終濃度為0.5M。