[發明專利]一種建立DOX調控的豬體細胞誘導重編程體系的方法

有效

• 申請號: 201410179808.0
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103923877A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 王華巖;段安琴;于童;王寧
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 西安億諾專利代理有限公司 61220
• 代理人: 康凱

技術領域

本發明涉及一種體細胞系重編程的建立方法，尤其涉及一種建立DOX調控的豬體細胞誘導重編程體系的方法。

背景技術

?多能干細胞細胞具有自我更新能力和分化能力，對于細胞治療意義深遠。胚胎干細胞（Embryonic?stem?cells，ESCs）是從內細胞團（inner?cell?mass，ICM）中分離出來的多能干細胞，具有自我更新能力和三胚層分化能力，但由于涉及胚胎倫理問題制約了其應用。成體干細胞也可以應用于細胞治療，但其有限的分化能力很大程度的限制了成體干細胞的應用。而誘導多能干細胞的出現很好的解決了上述問題。

經過十多年的努力，多能干細胞生物學已然成為一個欣欣向榮的研究學科。2006年，Takahashi和Yamanaka用逆轉錄病毒介導四因子即Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc成功誘導出了小鼠多能干細胞，該細胞具有小鼠ES的特征，將其命名為誘導多能干細胞（induced?pluripotent?stem?cells，iPS）[Takahashi?K,?Tanabe?K,?et?al.?Cell?[J].?Induction?of?pluripotent?stem?cells?from?adult?human?fibroblasts?by?defined?factors,?2007,?131(5):861-872]。隨后，人、大鼠、獼猴、牛、羊、豬、馬、兔等物種也建立了iPS細胞系。

?????????長期以來，豬一直是醫學研究上的理想實驗動物。豬在解剖、生理結構及新陳代謝等方面與人類具有較高的相似度，是人類疾病模型和器官移植的理想實驗動物。多家實驗室將豬體細胞感染多種高滴度的逆轉錄病毒或慢病毒載體，誘導形成了iPS，但這樣的iPS具有不同的基因型，為進一步研究帶來了干擾。同時，多種慢病毒或逆轉錄病毒載體拷貝數的隨機整合，導致了重編程效率低，僅0.001%-0.1%。而這樣誘導形成的iPS通常擁有15個拷貝數甚至更多的插入[Wernig?M,?Meissner?A,et?al.?Nature?[J].?In?vitro?reprogramming?of?fibroblasts?into?a?pluripotent?ES-cell-like?state,?2007,?448(7151):318-324]，揭示重編程過程需要高滴度或一定化學計量的轉錄因子表達。這種多病毒載體隨機高拷貝插入和重編程的隨機性使機制研究及用小分子替代轉錄因子的研究更具難度。

發明內容

為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發明提供了一種建立DOX調控的豬體細胞誘導重編程體系的方法，便于研究豬體細胞體重編程體系，TetO-FUW-OSKM為四因子四串聯，解決了四因子隨機插入拷貝數不一的問題，研究人員可以使用第二代成纖維細胞在DOX條件下直接誘導細胞重編程，不用重新導入外源基因，不用考慮病毒感染效率。

本發明的技術解決方案是：本發明提供了一種建立DOX調控的豬體細胞誘導重編程體系的方法（圖1），其特殊之處在于：該方法包括以下步驟：

1）豬胎兒成纖維細胞的原代分離培養；

2）豬胎兒成纖維細胞重編程為第一代iPS；

3）第一代iPS分化為豬第二代成纖維細胞；

4）第二代成纖維細胞重編程為第二代iPS，其具體實現方式：

4.1）將上述豬第二代成纖維細胞在+DOX的iPS培養條件下培養5d；

4.2）計數重鋪于feeder上，培養2d后出現克隆；

4.3）在體式顯微鏡下，用吸胚針將克隆挑出，單克隆接于Feeder上并將其擴增至????????????????????????????????????????????????凍存于液氮中。

上述步驟1）的具體實現方式是：

1.1）取妊娠28d的母豬為實驗材料，盡快將包含胎兒的整個子宮帶回實驗室；

1.2）將子宮用手術剪剪開，取出羊水包裹的胎兒，放置于含1%青鏈霉素的PBS（—）中；

1.3）用兩把鑷子小心的將羊水膜及胎盤與胎豬分離，將胎豬放入新的含1%青鏈霉素的PBS（—）中，盡量去除血細胞；

1.4）用手術剪將胎豬的頭、尾、四肢及內臟去除干凈，即只取胎豬軀干部分，將組織上的血細胞去除干凈；