[發(fā)明專利]一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410179490.6 | 申請日： | 2014-04-30 |
| 公開（公告）號： | CN103966182A | 公開（公告）日： | 2014-08-06 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 林家旺;魏超;魏劭 | 申請（專利權(quán)）人： | 廈門安普利生物工程有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/12 | 分類號： | C12N9/12;C12R1/19 |
| 代理公司： | 廈門市精誠新創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35218 | 代理人： | 方惠春 |
| 地址： | 361000 福建省*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 提取 純化 tth dna 聚合 方法 | ||
1.一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其步驟為，
1）工程菌的活化和表達(dá)：取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，離心；再用緩沖液A重懸得到表達(dá)的工程菌；
2）粗蛋白制備：將所述表達(dá)的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，再加入吐溫-20，冰上處理一段時間，15000g/4℃/20分鐘，得到的上清即為粗蛋白；
3）粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀；
4）上清液補足NaCl后流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液平衡；所述結(jié)合緩沖液為20mM Tris-HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌，所述洗滌緩沖液為20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑；最后用洗脫液洗脫目的蛋白，所述洗脫液為20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脫液；含目的蛋白的洗脫液用sephadexG25脫鹽，脫鹽緩沖液為緩沖液B： 10mM Tris-HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脫鹽后即得到純化的Tth DNA聚合酶；
任選的，得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%，-20℃保存。
2.權(quán)利要求1所述的提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述Tth DNA聚合酶工程菌為從嗜熱棲熱菌HB-8中PCR擴增得到PCR產(chǎn)物，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ、SalⅠ雙酶切后克隆入經(jīng)NdeⅠ、SalⅠ雙酶切的PET28a載體上，構(gòu)建表達(dá)載體PET28a-taq，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)，即獲得生產(chǎn)重組Tth DNA聚合酶的工程菌株。
3.權(quán)利要求2所述的提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述PCR擴增所用的引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟1）為取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4小時后加入1M IPTG至終濃度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培養(yǎng)8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；12000rpm,4℃離心5分鐘收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，12000rpm，4℃離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達(dá)的工程菌；所述緩沖液A為20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0。
5.權(quán)利要求1或2所述的提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟2）為將所述表達(dá)的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為1mM，加入吐溫-20使體積百分比為0.5%，冰上處理45分鐘，15000g/4℃/20分鐘，得到的上清即為粗蛋白。
6.權(quán)利要求1或2所述的提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟3）為粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘，15000g，4℃離心20分鐘，去除沉淀。
7.權(quán)利要求1或2所述的提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟4）為上清液補足NaCl至終濃度為0.5M。
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