[發明專利]水稻胞質型PPDK蛋白抗原表位、其抗體及應用

有效

• 申請號: 201410178912.8
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103952383A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 王真梅;曾漢來;何瑩;李海霞;劉雄鋒
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

技術領域

本發明屬于分子生物學和免疫學領域。具體涉及一種水稻碳氮代謝相關的胞質型PPDK蛋白抗原表位、其抗體及應用。

背景技術

丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate?orthophosphate?dikinase或pyruvate?phosphate?dikinase，PPDK；E.C.2.7.9.1)是C₄途徑和景天科酸代謝(crassulacean?acid?metabolism，CAM)途徑的限速酶，催化三磷酸腺苷(adenosine?triphosphate,ATP)、丙酮酸和無機磷酸鹽(inorganic?phosphate，Pi)經三步反應生成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)，此反應具有可逆性。PPDK廣泛存在于高等植物中，玉米、水稻、擬南芥、高粱、甘蔗、家稗和Flaveria屬等植物的PPDK基因有很高的同源性。已有研究表明PPDK基因具有兩個不同的轉錄起始位點，分別受兩個啟動子控制。其中，長轉錄物翻譯為包含轉運肽的C₄型PPDK蛋白，具有組織特異性及光誘導性，而短轉錄物翻譯為不含有轉運肽的胞質型PPDK蛋白。胞質型PPDK的表達量較低，可能對pH維持和檸檬酸循環中間產物補償等非光合方面有重要作用。目前，對PPDK在C₃植物中的作用及非光合作用功能研究受到重視。

水稻至少有兩個PPDK編碼位點(PPDK1和PPDK2)，PPDK1基因定位在水稻第5染色體上，全長11kb，包含21個外顯子和20個內含子；由兩個功能獨立的啟動子，分別產生一個類C₄型PPDK-PPDKB(含有947個氨基酸殘基，分子量為102.8kDa)以及一個胞質型PPDK-CPDK1(含有882個氨基酸殘基，分子量為96.2kDa)。PPDK2基因定位在水稻第3染色體上，包含18個外顯子，僅編碼一個由887氨基酸殘基組成、分子量為96.6kDa的胞質型PPDK——CPDK2。胞質型PPDK大量存在于發育的水稻籽粒中，其功能可能與籽粒發育早期的代謝相關，如自由氨基酸合成、脂肪酸從頭合成以及脂類代謝等(Imaizumi等1997)。

迄今為止，關于水稻胞質型PPDK的研究還有待深入。蛋白質印記技術(Western?Blot)利用抗原和抗體特異性結合來定性定量檢測復雜樣品中某目的蛋白，具有靈敏度高、特異性好、操作簡便和結果直觀等優點。傳統多克隆抗體制備過程多采用重組蛋白作為抗原，但重組蛋白的表達和純化復雜且繁瑣，在純化過程中不可避免的會摻入一些雜蛋白，即便是高純度的重組蛋白，由于多個抗原決定簇的存在，所制備的抗體仍有可能存在交叉反應，從而影響抗體的特異性。為解決抗體特異性問題，多采用合成抗原表位的方法來制備抗體，即根據預測的抗原表位合成一段多肽作為抗原，多肽合成技術成熟，具有易操作、準確性高和成本低廉的優點。

發明內容

本發明通過對水稻胞質型PPDK蛋白的抗原表位進行預測并合成相應多肽作為抗原，制備了胞質型PPDK蛋白多克隆抗體，該抗體具有很高的靈敏性和特異性。具體地，本發明包括以下幾方面：

本發明的第一個目的是提供一種水稻胞質型PPDK蛋白的抗原表位。通過分析水稻胞質型PPDK蛋白的特性(親水性、表露性和柔韌性等)及二級結構，得到多個抗原表位序列，綜合考慮多肽的長度等因素，確定了一條最有效的抗原表位，其多肽的氨基酸序列為EACQQYQAAGKT(SEQ?ID?NO:1所示)。

本發明的第二個目的是提供所述抗原表位的用途。該抗原表位用于制備人工合成多肽抗原以及水稻胞質型PPDK蛋白多克隆抗體。

本發明的第三個目的提供是一種水稻胞質型PPDK蛋白多克隆抗體的制備方法：首先對所述多肽的氨基酸序列進行末端修飾，然后將修飾后的多肽經過固相合成并與載體蛋白偶聯，得到抗原，用抗原免疫動物后，取動物的多抗血清并從中分離純化多克隆抗體。

所述末端修飾為在氨基酸序列的C端增加一個半胱氨酸殘基，修飾后的多肽的氨基酸序列為EACQQYQAAGKTC((SEQ?ID?NO:2所示)。