[發(fā)明專利]一種基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410178020.8
• 申請(qǐng)日: 2014-04-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105018582A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫子奎;高文學(xué);丁方美;王鋒;方鈺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海桑尼生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

根據(jù)β-酪蛋白的堿基序列，設(shè)計(jì)出含有Dde?I酶切位點(diǎn)的引物，所述引物的序列為：

上游引物：5’ACC?CCA?ATT?TCT?TAA?CCA?AAC?C3’

下游引物：5’GAG?TAA?GAG?GAG?GGA?TGT?TTT?GTG?GGA?GGC?TCT3’；

利用引物擴(kuò)增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中產(chǎn)生一個(gè)Dde?I酶切位點(diǎn)；

用引物對(duì)待檢測(cè)的奶牛基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

利用限制性內(nèi)切酶Dde?I進(jìn)行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行判斷。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行判斷，具體為：

如果PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物無(wú)法被Dde?I切開(kāi)或存在一個(gè)253bp的條帶,則β-酪蛋白為A1β-酪蛋白；

如果PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切后同時(shí)存在一個(gè)218bp的條帶和一個(gè)35bp的條帶,則β-酪蛋白為A2β-酪蛋白；

如果PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切后同時(shí)存在一個(gè)218bp的條帶和一個(gè)253bp的條帶,則β-酪蛋白為A1A2β-酪蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述酶切的體系包括PCR產(chǎn)物9ul、限制性內(nèi)切酶0.2ul和緩沖液1ul；所述酶切的條件為37℃孵育1-8h，65℃熱失活20min。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近設(shè)計(jì)出含有Dde?I酶切位點(diǎn)的引物，所述酶切的條件為37℃孵育2h，65℃熱失活20min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的體系為DNA模板50ng、熱啟動(dòng)Taq?DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM?dNTP1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend?PCR?Buffer10ul、加ddH2O至20ul。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件：在溫度為92-95℃時(shí)預(yù)變性5min，然后在溫度為92-95℃時(shí)變性15s、在溫度為52-65℃時(shí)退火30s、在溫度為68-72℃時(shí)延伸30s，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，最后在溫度為68-72℃時(shí)延伸7min。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述基于酶切法檢測(cè)β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件：在溫度為95℃時(shí)預(yù)變性5min，然后在溫度為95℃時(shí)變性15s、在溫度為61℃時(shí)退火30s、在溫度為72℃時(shí)延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在溫度為72℃時(shí)延伸7min。