[發明專利]用于基于AFLP的高通量多態性檢測的方法

有效

• 申請號: 201410177894.1
• 申請日: 2006-12-20
• 公開（公告）號: CN103937899B
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: M·J·T·范艾克;A·P·索倫森;M·G·M·范施里克
• 申請（專利權）人: 凱津公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司11314
• 代理人: 程偉

1.高通量發現、檢測和基因分型多個樣品中一種或多種遺傳標記的方法，包括下述步驟：

a)提供來自多種樣品的DNA；

b)用至少一種限制性內切酶限制DNA以產生限制性片段；

c)連接接頭與限制性片段，產生接頭-連接的限制性片段；

d)用引物對擴增接頭-連接的限制性片段，其中所述引物中的至少一個和至少部分接頭互補，從而針對每個樣品產生標記的擴增的接頭連接的限制性片段的文庫；

e)使用高通量測序技術測序該文庫，并選擇被測序至少6倍的擴增的接頭-連接的限制性片段；

f)使用標識符標記鑒定文庫內和/或文庫之間的遺傳標記；

g)測定文庫中遺傳標記的共顯性基因型，

其中所述方法不用于人和動物疾病的診斷。

2.根據權利要求1所述的方法，其中遺傳標記為AFLP標記或SNP標記。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中測序基于合成的測序。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其中測序基于焦磷酸測序。

5.根據權利要求1所述的方法，其中測序在固體載體上進行的。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述固體載體是珠粒。

7.根據權利要求1所述的方法，其中測序包括下述步驟：

-退火擴增的接頭-連接的限制性片段至珠粒，每個珠粒同單個接頭-連接的片段退火；

-在油包水型微型反應器中乳化珠粒；每個油包水型微型反應器包括單個珠粒；

-進行乳劑PCR以在珠粒表面上擴增接頭-連接的限制性片段；

-將珠粒裝填在池中，每個池包括單個珠粒；和

-產生焦磷酸鹽信號。

8.根據權利要求1所述的方法，其中標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的平均冗余度為至少6。

9.根據權利要求1所述的方法，其中標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的平均冗余度為至少7。

10.根據權利要求1所述的方法，其中標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的平均冗余度為至少8。

11.根據權利要求1所述的方法，其中標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的平均冗余度為至少9。

12.根據權利要求1所述的方法，其中測定每個接頭-連接的限制性片段的序列至少6倍。

13.根據權利要求1所述的方法，其中測定每個接頭-連接的限制性片段的序列至少7倍。

14.根據權利要求1所述的方法，其中測定每個接頭-連接的限制性片段的序列至少8倍。

15.根據權利要求1所述的方法，其中測定每個接頭-連接的限制性片段的序列至少9倍。

16.根據權利要求1所述的方法，其中在內切核苷酸酶限制和接頭連接之間，通過變性步驟進行大小選擇。

17.根據權利要求1所述的方法，其中DNA選自基因組DNA、cDNA、BAC、YAC、整體基因組擴增的DNA或PCR產物。

18.根據權利要求1所述的方法，其中接頭為雙鏈的合成寡核苷酸接頭，其具有一個適合于限制性片段的一個末端或兩個末端的末端。

19.根據權利要求1所述的方法，其中DNA被兩個限制性內切酶限制。

20.根據權利要求1所述的方法，其中至少一個限制性內切酶是稀有的切割酶。

21.根據權利要求1所述的方法，其中至少一個限制性內切酶為常見切割酶。

22.根據權利要求1所述的方法，其中引物包含1至10個核苷酸。

23.根據權利要求1或2所述的方法，其中使用三個或更多個限制性內切酶的組合限制DNA。

24.權利要求1或2任一項所定義的方法用于AFLP和/或SNP標記序列的共顯性評分的用途。

25.高通量測序方法用于多態性的檢測、發現和基因分型、用于基因分型多個樣品中一種或多種遺傳標記的用途，包括步驟：

a)提供來自多種樣品的DNA；

b)用至少一種限制性內切酶限制DNA以產生限制性片段；

c)將標記的接頭與限制性片段連接，產生標記的接頭-連接的限制性片段；

d)用引物對擴增標記的接頭-連接的限制性片段，其中所述引物中的至少一個和至少部分接頭互補，從而針對每個樣品產生標記的擴增的接頭-連接的限制性片段的文庫；

e)使用高通量測序技術測序該文庫，并選擇被測序至少6倍的擴增的接頭-連接的限制性片段；

f)使用標識符標記鑒定文庫內和/或文庫之間的遺傳標記；

g)測定文庫中遺傳標記的共顯性基因型，并將基因型用于基因分型目的，所述基因分型目的包括遺傳作圖、QTL定位、精細定位基因/特性、連鎖不平衡作圖、標記輔助的反交、遺傳距離分析、發現與特性或表型有關的標記。