[發(fā)明專利]具有抗腫瘤活性的靶向PD-L1IgV親和肽D2

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410177417.5
• 申請日: 2014-04-29
• 公開（公告）號: CN103936836A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高艷鋒;劉蓓媛;祁元明;李國棟
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;A61K38/10;A61P35/00;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性多肽產(chǎn)品的篩選、制備及應用，更具體的，本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的靶向PD-L1?IgV的D-構(gòu)型親和肽D2產(chǎn)品及其制備和應用。

背景技術(shù)

近年來，腫瘤的防控形勢非常嚴峻。隨著臨床診斷、手術(shù)治療、化療和放療等水平的提高，使得一部分病人能夠得到早發(fā)現(xiàn)、早治療，并且獲得較好的預后，但是，尋找新的治療手段和治療藥物一直是全球范圍內(nèi)的研究熱點。與傳統(tǒng)的治療方法相比，腫瘤免疫治療能夠激活或者誘導腫瘤患者建立起對腫瘤抗原的特異性免疫應答，清除原發(fā)的腫瘤細胞，并且建立免疫記憶，阻止腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。

在腫瘤免疫治療過程中，負性共刺激分子主要介導免疫耐受和逃逸，而前人在腫瘤免疫治療過程中遇到的最大挑戰(zhàn)就是由于腫瘤免疫耐受和逃逸所導致的療效不佳。因此，探討通過抑制負性共刺激分子所介導的信號通路以打破機體已經(jīng)建立的對腫瘤細胞的免疫耐受具有重要的理論意義和應用價值。

T細胞的激活需兩個來自細胞外的信號刺激，即淋巴細胞活化的雙信號作用。細胞活化的第一信號主要來自細胞抗原識別受體（TCR?）與MHC?分子抗原肽復合物的特異性結(jié)合，此過程為抗原識別。細胞活化的第二信號又稱共刺激信號，是由抗原遞呈細胞（APC）和細胞表面的粘附分子提供。這些粘附分子被稱為共刺激分子，是一類細胞膜表面分子，可為?T、B?細胞的活化提供輔助信號，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、活化及分化。根據(jù)產(chǎn)生的效應不同，可將共刺激分子分為正性共刺激分子和負性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、ICOS、4-1BB等分子，而負性共刺激分子則包括CTLA-4、PD-1、TIM-3等分子。

PD-1?/PD-L1作為B7/CD28家族成員，已被證實通過抑制?T?細胞的活化和增殖來負調(diào)控免疫應答，并在調(diào)節(jié)免疫耐受、腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。因而利用PD-L1的阻斷劑作為腫瘤免疫治療藥物或佐劑具有很好的應用前景和安全性，而現(xiàn)有技術(shù)中，尚缺少較好的PD-L1的阻斷劑產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種具有較好抗腫瘤活性的靶向PD-L1IgV的D-構(gòu)型親和肽D2產(chǎn)品，可以特異性利用PD-L1I蛋白IgV區(qū)（D-PD-L1IgV）作為結(jié)合靶點，從而最終阻斷PD-1?/PD-L1的活化，解除對T細胞的活化和增殖的抑制作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

具體而言，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種具有抗腫瘤活性靶向PD-L1IgV親和肽D2，屬于D-構(gòu)型，特異性結(jié)合于PD-L1?IgV區(qū)，其氨基酸序列為：Lys-His-Ala-His-His-Thr-His-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro，即K-H-A-H-H-T-H-N-L-R-L-P，分子量為1459.8。

所述具有抗腫瘤活性靶向PD-L1IgV親和肽D2，添加藥學上可接受的載體或/和添加劑后，在制備抗結(jié)腸癌（CT26）藥物中作為主要活性成分發(fā)揮作用。

所述具有抗腫瘤活性靶向PD-L1IgV親和肽D2，通過Fomc固相多肽合成法人工合成。

現(xiàn)有技術(shù)中對PD-1/PD-L1復合物的晶體結(jié)構(gòu)研究認為，與受體PD-1結(jié)合的部位主要是PD-L1的胞外段IgV區(qū)，因此發(fā)明人通過構(gòu)建人PD-L1?IgV區(qū)的原核表達載體，得到人PD-L1胞外段IgV區(qū)蛋白，并以其為靶點來篩選親和肽，進而對其作為腫瘤免疫治療藥物和佐劑的可能性進行研究。

在對靶點進行高通量篩選親和肽過程中，發(fā)明人采用了庫容量大、操作簡便的噬菌體展示肽庫技術(shù)進行了篩選。噬菌體展示肽庫技術(shù)是將外源蛋白或多肽序列插入在M13噬菌體衣殼蛋白pⅢ的N末端，通過蛋白的融合表達將插入的隨機多肽序列展示在噬菌體表面。由于展示多肽位于pⅢ的N末端，這些小肽通常能夠保持較為獨立的空間結(jié)構(gòu)，從而能夠模擬配體與特異性受體靶標相互作用。由于通過噬菌體展示肽庫篩選所得到的多肽均為天然氨基酸殘基所組成，易被酶降解且體內(nèi)半衰期較短。鏡像噬菌體篩選技術(shù)即以篩選靶蛋白的D-構(gòu)型鏡像分子為靶標，通過噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選能夠與其結(jié)合的多肽配基，再合成這些多肽配基的鏡像分子—D-構(gòu)型多肽配基。由于篩選得到的天然多肽配基能特異性結(jié)合D-構(gòu)型靶蛋白，根據(jù)鏡像對稱關(guān)系，D構(gòu)型多肽配基也能特異性結(jié)合天然構(gòu)型的靶蛋白，因此該D-構(gòu)型多肽即為天然靶蛋白的鏡像配基。因此，發(fā)明人選用由D-構(gòu)型氨基酸人工合成的PD-L1?IgV區(qū)蛋白作為靶點，通過鏡像噬菌體篩選技術(shù)得到D-構(gòu)型的親和肽，從而大幅度提高其抵抗酶降解的能力以延長體內(nèi)作用半衰期。