[發(fā)明專利]一種制備阿托伐他汀手性中間體的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410176223.3
• 申請(qǐng)日: 2014-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103911403A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳依軍;茍旭東;吳旭日
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P13/00
• 分類號(hào): C12P13/00;C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 張鉑

1.一種制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)向重組大腸桿菌發(fā)酵液中加入底物6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、助溶劑二甲基亞砜、共底物葡萄糖，構(gòu)建原位生物合成體系；

所述發(fā)酵菌體為含重組共表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌；底物濃度為1～55g/L，優(yōu)選35g/L；助溶劑二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為0％-10％，優(yōu)選5％，共底物葡萄糖與底物6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的摩爾比為20:1～0.5:1，優(yōu)選1.2:1；

(2)步驟(1)所得反應(yīng)體系在振蕩或攪拌條件完成，反應(yīng)液pH范圍為5.0～9.0，優(yōu)選7.0，反應(yīng)溫度為15～35℃，優(yōu)選20℃。

2.反應(yīng)完成后乙酸乙酯萃取后得到6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯純品。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的重組質(zhì)粒為含羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶基因的重組共表達(dá)載體。

4.根據(jù)重組方案不同羰基還原酶基因序列可以是SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2；葡萄糖脫氫酶基因序列可以是SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的表達(dá)載體為原核生物共表達(dá)載體，含有2個(gè)或2個(gè)以上多克隆位點(diǎn)(MCS)；重組共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方案特征在于，方案1：羰基還原酶基因可位于MCS1，葡萄糖脫氫酶基因位于MCS2，重組質(zhì)粒為p-gdh-cr1；方案2：羰基還原酶基因在表達(dá)載體MCS2，葡萄糖脫氫酶基因插入MCS1，重組質(zhì)粒為p-cr1-gdh。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含重組共表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌，其特征在于，所含的重組表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為pGC，反應(yīng)過(guò)程中羰基還原酶催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯還原反應(yīng)和葡萄糖脫氫酶介導(dǎo)的內(nèi)源性輔酶循環(huán)系統(tǒng)完全匹配，無(wú)需利用外源性輔酶；

權(quán)利要求1所述的制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的方法中，步驟(1)所述的大腸桿菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于，含重組共表達(dá)質(zhì)粒的工程菌在LB培養(yǎng)基中，37℃下振搖培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD₆₀₀＝0.8±0.1后，加入0.5mM的誘導(dǎo)劑IPTG，在15～35℃下繼續(xù)培養(yǎng)16h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，所述制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的方法還包括：步驟(2)反應(yīng)完成后將反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取，得到6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯油狀物。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，步驟(2)中，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH的試劑選自甲酸、乙酸、鹽酸、氨水、氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液。