[發明專利]長鏈二元酸生產菌株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410175556.4
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN103992959B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 賴小勤;晏禮明;楊勇;葛書華;陳遠童;陶勇;傅深展
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/64;C12P7/44;C12R1/72
• 代理公司: 北京怡豐知識產權代理有限公司11293
• 代理人: 于振強

1.一種長鏈二元酸生產菌株，其分類命名為假絲酵母菌(Candida?sp.)TDTC016，其保藏編號為：CGMCC?No.8928。

2.根據權利要求1所述的長鏈二元酸生產菌株，其特征在于所述假絲酵母菌基因組里增加了一個拷貝的CYP單加氧酶基因。

3.根據權利要求2所述的長鏈二元酸生產菌株，其特征在于所述CYP單加氧酶基因堿基序列如序列表的序列7所示。

4.如權利要求1所述的長鏈二元酸生產菌株的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)準備引物CandidaCYP-F、CYP-R、GEMura-F和Ura-R；

(2)準備長鏈二元酸生產菌的尿嘧啶營養缺陷型菌株，并制備感受態細胞；

(3)使用步驟(1)中的引物進行擴增分別得到CYP單加氧酶基因片段CandidaCYP-F、CYP-R和Ura3基因片段GEMura-F、Ura-R，再經過一輪重疊PCR將兩個片段連接起來，再將此重疊PCR擴增的產物整合到尿嘧啶營養缺陷型菌株基因組里；

(4)通過PCR擴增、純化、電轉、篩選、鑒定，得到尿嘧啶自養型長鏈二元酸生產菌株。

5.根據權利要求4所述的長鏈二元酸生產菌株的制備方法，其特征在于所述篩選步驟中使用的篩選標記為Ura3。

6.據權利要求4所述的長鏈二元酸生產菌株的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的長鏈二元酸生產菌株為假絲酵母(Candida?sp.)DC12的尿嘧啶營養缺陷型菌株。

7.如權利要求1所述的長鏈二元酸生產菌株在生產長鏈二元酸中的應用。

8.如權利要求7所述的長鏈二元酸生產菌株在生產長鏈二元酸中的應用，其特征在于發酵結束后，將發酵液加熱至70～80℃；再將pH調至9～9.5，除去菌體沉淀，保留上清；脫色，溫度保持在70～90℃，得到濾清液，用酸酸化至pH2.5，70～90℃保溫，冷卻，離心或壓濾，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到長鏈二元酸。