[發(fā)明專利]多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410174666.9
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN103966112A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢衛(wèi)東;付云芳;蔡長龍;毛培宏;王婷;趙德志;施春陽
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12P19/60;C12R1/78
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)龍膽苦苷的轉(zhuǎn)基因酵母重組菌領(lǐng)域，具體涉及利用離子注入介導(dǎo)秦艽總DNA在酵母菌中遺傳轉(zhuǎn)化獲得的多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

龍膽苦苷(Gentiopicroside)，別名龍膽苦甙，分子式為C₁₆H₂₀O₉，分子量為356.11，為裂環(huán)環(huán)烯萜苷類化合物，屬于倍半萜類物質(zhì)，是藥用植物秦艽(Gentiana macrophylla)的主要藥用成分。近年來的研究表明，龍膽苦苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、健胃抗?jié)兊茸饔茫缱鳛閲乙活愋滤幾⑸溆们佚埧嗨兀瑸榍剀刺崛∥稞埬懣嘬盏膬龈煞坩槪糜邳S疸型病毒性肝炎治療。

龍膽苦苷多來源于龍膽科多年生草本植物秦艽。秦艽為龍膽科、龍膽屬多年生草本植物，是我國重要的中藥材之一。秦艽生長在高海拔地區(qū)，生長周期長，易受季節(jié)變化影響。近年來因秦艽具有很高的藥用價(jià)值，過渡采挖使野生秦艽資源出現(xiàn)嚴(yán)重匱乏，加上秦艽人工栽培存活率低的問題，導(dǎo)致龍膽苦苷的供應(yīng)量難以滿足臨床需求。因此，迫切需要尋求及擴(kuò)大龍膽苦苷新藥源途經(jīng)以滿足臨床上對其日益增長的需求。

目前，Tiwari等運(yùn)用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出秦艽毛狀根，但其不能生產(chǎn)龍膽苦苷。此外，齊香君等運(yùn)用藥源植物秦艽細(xì)胞生產(chǎn)龍膽苦苷，其龍膽苦苷產(chǎn)量僅為0.242mg/g，而且其發(fā)酵周期長。上述研究目前都未能獲得理想的結(jié)果。在秦艽資源開發(fā)研究方面，國外尚未報(bào)道。因此，亟需尋求新的研究思路解決龍膽苦苷來源短缺問題。

近年來，分離天然產(chǎn)物生物合成基因，并借助酵母細(xì)胞工廠大量而經(jīng)濟(jì)地生物合成植物天然產(chǎn)物成為有效途徑之一。然而，植物萜類化合物，如單萜、倍半萜以及雙萜等高級(jí)萜類不僅擁有特異的合成途徑，且具有獨(dú)特的酶促反應(yīng)機(jī)制。同時(shí)，許多已知代謝途徑不能作為參考，植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)多且復(fù)雜，加上部分關(guān)鍵代謝酶基因處于低表達(dá)水平，很難從蛋白分子水平獲得表達(dá)。

近年來，在植物天然產(chǎn)物生物合成基因信息及生物合成途徑尚未闡明前，Lü等通過Ar+和N+注入介導(dǎo)麻黃基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母，獲得遺傳穩(wěn)定酵母工程菌，麻黃堿和偽麻黃堿產(chǎn)量分別為18.85mg/L和4.11mg/L。Jin等利用低能離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母，獲得了遺傳穩(wěn)定的酵母工程菌，其五環(huán)三萜苷類物質(zhì)甘草酸的最高產(chǎn)量達(dá)114.49mg/L。同時(shí)，由于酵母自身存在甲羥戊酸(Mevalonate，即MVA)途徑，可自我合成萜類物質(zhì)前體異戊二烯焦磷酸，這為利用微生物合成萜類化合物龍膽苦苷提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)平臺(tái)。目前，國外尚未見利用低能離子注入介導(dǎo)藥用植物基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)藥用有效成分的重組菌的研究報(bào)道。具體在遺傳改造酵母生物合成龍膽苦苷的方面，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種多形漢遜酵母重組菌株及其在龍膽苦苷生物合成中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。

一種多形漢遜酵母重組菌株，該重組菌株的分類命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)，所述重組菌株保藏于CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No.8998。

所述重組菌株的篩選方法，包括以下步驟：

1)運(yùn)用低能離子注入介導(dǎo)秦艽基因組DNA轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母出發(fā)菌株；

2)重組菌株初篩：挑取在YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的經(jīng)過步驟1)處理后的出發(fā)菌株的菌落進(jìn)行YPD液體發(fā)酵，離心取發(fā)酵液，采用Molish反應(yīng)和Fehling試驗(yàn)對重組菌株的發(fā)酵液進(jìn)行分析，初步定性分析發(fā)酵液中是否存在龍膽苦苷；

3)將經(jīng)過定性方法初篩得到的重組菌株進(jìn)一步進(jìn)行YPD液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用薄層層析和高效液相色譜分析發(fā)酵所得發(fā)酵液，從而對重組菌株進(jìn)一步篩選鑒定。

所述出發(fā)菌株為多形漢遜酵母H.polymorpha DL-1(來源為ATCCNo.26012)。

所述低能離子注入的條件為：注入離子為N+，注入劑量為1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量為15～25KeV，脈沖時(shí)間為5～10s，間隔時(shí)間為5～10s，真空度為1.5～2.0×10^-3Pa。

所述重組菌株的發(fā)酵方法包括以下步驟：于37℃、轉(zhuǎn)速為300r/min條件下培養(yǎng)60～96h。