[發明專利]一種鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶的基因、其干擾基因及其應用

有效

• 申請號: 201410172992.6
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN103923931A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 楊君;夏悅昕;白敬;屈明博;劉田;姜秀萍;楊青
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/06;C12N15/113;C12N15/11;A01P7/04
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及鱗翅目昆蟲亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶(OfDHFR)的基因、其干擾基因及其應用。

背景技術

亞洲玉米螟(Ostrinia?furnacalis?Guenée)屬于鱗翅目螟蛾科，以玉米、棉花、谷子、高粱等為食，每年造成玉米的減產量可達總產量的10％-30％，而且在我國分布區域跨度大，是我國重要的農業害蟲。由于其鉆蛀特性，防治困難，目前尚沒有特效的化學農藥。RNA干擾(RNA?interference,RNAi)是生物體內抑制特定基因表達的一種現象，小干擾RNA被認為是一種快捷、高效的調控體內基因表達的方法。以害蟲關鍵生理功能基因為生物分子靶標，通過干擾其活性達到抑制生長發育和殺蟲目的，具有顯著的商業價值和應用前景。

二氫葉酸還原酶(dihydrofolate?reductase，DHFR，EC1.5.1.3)是細胞內葉酸代謝的關鍵酶，它在輔酶NADPH的參與下，催化底物二氫葉酸還原為四氫葉酸(tetrahydrofolate，THF)。THF可以作為一碳單位的傳遞體。而一碳單位是生物體新陳代謝過程中含有一個碳原子的基團，例如甲基、羥甲基等，其主要生理功能是作為嘌呤和嘧啶的合成原料，是氨基酸和核苷酸聯系的紐帶。除此之外，THF還可參與到在胸苷酸合酶(TS)的催化下，脫氧尿苷一磷酸(dUMP)轉變為脫氧胸苷一磷酸(dTMP)的生物合成中，這是dTMP從頭生物合成的唯一路徑，dTMP是DNA合成所必須的前體物質，而DNA的合成又與細胞復制密切相關。由于昆蟲不能自身合成THF，必須要從外界獲得葉酸再轉化為DHF，進而由DHFR催化合成THF，所以DHFR對于昆蟲生長發育起著極其重要的作用，通過對其功能的干擾和抑制可實現害蟲防治的目標。

經對現有技術的文獻檢索發現，尚未有將DHFR基因及其干擾RNA用于害蟲防治的應用或報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種全新的亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶(OfDHFR)的基因核苷酸序列，以及OfDHFR基因的干擾RNA分子在亞洲玉米螟防控中的用途。

本發明公開了一種亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶OfDHFR基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。

本發明公開了一種亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶OfDHFR基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

本發明還公開了所述鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因干擾RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。根據亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶OfDHFR基因序列設計合成的dsRNA，其核苷酸序列包括正義鏈序列為SEQ?ID?NO：4，反義鏈為SEQ?ID?NO：5。可以特異性的沉默亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶的基因的mRNA的表達，有效控制玉米螟成蟲產卵，減少幼蟲數量，從而減輕下代玉米螟危害，有效控制蟲害。

附圖說明

圖1：從亞洲玉米螟幼蟲中提取的總RNA的凝膠電泳圖

圖2：PCR產物凝膠電泳圖

圖3:3’RACE的PCR產物凝膠電泳圖

圖4：5’RACE的PCR產物凝膠電泳圖

圖5：利用OfDHFR-F1/OFDHFR-R1和OfDHFR-F1/OFDHFR-R2引物擴增的PCR產物凝膠電泳圖

圖6：利用RNAi-DNA-F/RNAi-DNA-R引物擴增的PCR產物凝膠電泳圖

圖7：dsRNA的凝膠電泳圖

圖8：RNA干擾后雌蟲OfDHFR的表達情況

圖9：RNA干擾后雌蟲的產卵情況

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

亞洲玉米螟(Ostrinia?furnacalis)由中國科學院植物保護研究所贈與。

下述實施例中涉及到的使用試劑盒的實驗操作，均按照試劑盒說明書進行操作。

實施例1

亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶(OfDHFR)基因的獲得

一.亞洲玉米螟幼蟲的總RNA提取

使用RNAiso?plus(Code?No.D9108A)對亞洲玉米螟(幼蟲)進行總RNA提取，獲得其總RNA。

取1ul上述亞洲玉米螟總RNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1，RNA樣品的結果清晰，符合質量要求適合進行下一步實驗。

二.RT-PCR

以亞洲玉米螟總RNA為模板，進行反轉錄，合成cDNA。