[發(fā)明專利]基于超級三明治DNAzyme的電化學(xué)細胞傳感器的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410172964.4
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN103983670A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王宗花;趙凱;夏建飛;張菲菲;遲德玲;夏霖;鹿才余;夏臨華;李延輝;夏延致
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用，尤其涉及基于超級三明治DNAzyme的電化學(xué)細胞傳感器的制備方法。

背景技術(shù)

早期準(zhǔn)確地檢測癌癥細胞對于臨床診斷以及檢測癌癥相關(guān)過程的監(jiān)測具有非常重要的作用。當(dāng)前有許多檢測方法，如流式細胞術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)、免疫組織化學(xué)、熒光檢測以及場效應(yīng)晶體管等，然而這些方法存在花費高、耗時長或者需要復(fù)雜的儀器等缺點。電化學(xué)方法，由于其響應(yīng)快、成本低以及易于操作等優(yōu)點，吸引了廣大科學(xué)家，是一種癌癥監(jiān)測的理想方法。然而，目前的電化學(xué)細胞傳感器很少，這是由于細胞膜的不導(dǎo)電性極大限制了氧化還原物質(zhì)與目標(biāo)細胞之間的相互作用。為了解決這一難題，媒介轉(zhuǎn)換法或許是細胞檢測的理想方法。眾所周知，適配體與目標(biāo)物之間的結(jié)合力比互補鏈之間結(jié)合力大的多，因此靶細胞的加入能夠取代互補鏈，這樣就將適體-細胞之間的作用轉(zhuǎn)化為基于DNA的信號放大策略。

G-四聯(lián)體DNAzyme，由hemin及富G堿基的DNA序列組成，是一種有效放大檢測分析物的催化工具。由于其相比于HRP的顯著優(yōu)勢，目前被廣泛地用于各類生化反應(yīng)中。目前，基于G-四聯(lián)體DNAzyme發(fā)展了一種雙功能的電化學(xué)傳感器。然而，這種放大模式在催化性能方面存在缺陷，因為每一個目標(biāo)DNA只能形成一個G-四聯(lián)體DNAzyme。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供一種基于超級三明治DNAzyme的電化學(xué)細胞傳感器的制備方法，制備的電化學(xué)細胞傳感器能夠有效放大檢測分析物，每一個靶DNA能夠捕獲包含若干超級三明治DNAzyme結(jié)構(gòu)DNA納米線，因此能夠獲得比傳統(tǒng)三明治結(jié)構(gòu)更大的電化學(xué)信號。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于超級三明治DNAzyme的電化學(xué)細胞傳感器的制備方法，包括如下步驟：

1)制備S1/S2-Fe₃O₄復(fù)合物：

首先將10～200μL10mg/mL的羧基化磁珠用100～800μL10mM的咪唑-鹽酸溶液清洗三次，加入0.1～1.0mM1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺/0.1～1.0mM?N-羥基琥珀酰亞胺于37℃孵化30分鐘激活磁珠表面的羧基，隨后用100mM?pH8.0的PBS緩沖液清洗；之后，加入10～100μL0.1～5.0μM?K562適配體S1，37℃，反應(yīng)16～24小時，并輕微的震動，將形成的S1-Fe₃O₄復(fù)合物用磁鐵分離，并用PBS緩沖液清洗；最后，加入10～100μL0.1～5.0μM的互補探針S2，37℃反應(yīng)1～3小時，形成S1/S2-Fe₃O₄復(fù)合物，并將復(fù)合物于4℃下保存以待后續(xù)使用；

所述K562適配體S1的序列為：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCAGATCAGTCTATCTTCTCCTGATGGGTTCCTATTTATAGGTGAAGCTGGACACGGTGGCTTAGT-(CH2)6-NH2-3'，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；互補探針S2的序列為：5'-TGCGTCACTCTGGATACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

2)基于超級三明治DNAzyme的電化學(xué)細胞傳感器的制備

首先將白血病細胞K562離心并用100mM?PBS緩沖液水洗，得K562的細胞懸浮液，并將S1/S2-Fe₃O₄復(fù)合物加入系列濃度的細胞懸浮液中，于37℃反應(yīng)2～3小時；加入離心后的K562細胞時，適體S1與細胞強作用力迫使S1/S2雙聯(lián)結(jié)構(gòu)打開，將S2釋放到溶液中，磁性分離后，將修飾捕獲探針S3的金電極浸入到S2溶液中，37℃反應(yīng)1～3h以形成S3/S2雙聯(lián)；隨后，在0.1～5.0μM?S4、S5混合液中孵化2～4小時，并在0.2mM?hemin及0.5mM?MB溶液中浸泡2～4小時，得到基于超級三明治DNAzyme的電化學(xué)細胞傳感器；