[發(fā)明專(zhuān)利]改進(jìn)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410172357.8 | 申請(qǐng)日： | 2014-04-23 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN105018442A | 公開(kāi)（公告）日： | 2015-11-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 陳日東;鄭宋碩 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | APT治療公司 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N9/14 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N9/14 |
| 代理公司： | 北京市金杜律師事務(wù)所 11256 | 代理人： | 陳文平;徐志明 |
| 地址： | 美國(guó)密*** | 國(guó)省代碼： | 美國(guó);US |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 改進(jìn) en 腺苷 磷酸 磷酸酶 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及名稱為EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的現(xiàn)有技術(shù)腺苷三磷酸雙磷酸酶的改進(jìn)形式，在本文中命名為I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶。因此，在藥物領(lǐng)域中，其用于治療血栓溶解(thrombolytic)-相關(guān)的或炎癥-相關(guān)的疾病。
背景技術(shù)
PCT公布WO2011/088244描述了具有同源N-端的特定氨基酸序列的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶，其中超過(guò)80％的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶分子和同源物具有以ELVP開(kāi)始的相同N-端，并且具有與下文中所列的SEQ?ID?NO：180％相同的序列或相對(duì)于SEQ?ID?NO：1僅含有1-5個(gè)保守性置換的序列。所有EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶保持ADPase和ATPase活性。使用特定的構(gòu)建體在CHO細(xì)胞中獲得了這些EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶，所述構(gòu)建體導(dǎo)致N-端同質(zhì)性并且具有優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中源自可溶形式CD39L3的腺苷三磷酸雙磷酸酶的提高的半衰期。本申請(qǐng)通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件提高了這種EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的特性，在所述培養(yǎng)條件下制得了蛋白質(zhì)，使得獲得了甚至更長(zhǎng)的生物學(xué)半衰期，推測(cè)是由于更復(fù)雜的和更高水平的糖基化引起的。
發(fā)明內(nèi)容
制備了一組改進(jìn)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶，命名為I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶，其具有甚至優(yōu)于EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的藥代動(dòng)力學(xué)特性。
因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種改善EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的生物學(xué)特征的方法，該方法包括延遲谷氨酰胺至CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基中的添加直至培養(yǎng)一天后，所述CHO細(xì)胞經(jīng)修飾以含有所述EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的表達(dá)構(gòu)建體。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶(I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶)，其在狗中具有至少23小時(shí)的半衰期；和/或其具有至少70kD的分子量；和/或其糖基化模式具有提高的甘露糖5+甘露糖8+G2FS2/甘露糖6+甘露糖7+G2FS1比例。
附圖簡(jiǎn)述
圖1是用于制備EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶和I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的載體的示意圖。
圖2顯示了在用于該改進(jìn)的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)條件下，在特定克隆(350)的42次傳代中穩(wěn)定地產(chǎn)生改進(jìn)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶。
圖3顯示了與本發(fā)明的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶(標(biāo)記為條件D)的更高分子量相比，現(xiàn)有技術(shù)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶(標(biāo)記為條件A)的分子量的差異，通過(guò)與HPLC-尺寸排阻色譜偶聯(lián)的多角光散射分析來(lái)測(cè)量。
圖4顯示了這兩種形式的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶去糖基化后，相似的與HPLC-尺寸排阻色譜偶聯(lián)的多角光散射分析。如該圖中所示，去糖基化后的分子量是相同的。
圖5顯示了與現(xiàn)有技術(shù)的腺苷三磷酸雙磷酸酶(條件A)相比，本發(fā)明的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶(條件D)的糖基化模式。
圖6比較了本發(fā)明的I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶(條件D)在狗中的生物學(xué)半衰期與現(xiàn)有技術(shù)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶(條件A)的生物學(xué)半衰期。如看到的，本發(fā)明的腺苷三磷酸雙磷酸酶在狗中的半衰期長(zhǎng)得多，并且大約是25小時(shí)。
本發(fā)明的實(shí)施方式
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)現(xiàn)有技術(shù)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶的培養(yǎng)條件，可以獲得生物學(xué)半衰期的顯著提高。據(jù)認(rèn)為這些歸因于在這些條件下增強(qiáng)的糖基化水平和更高的糖基化復(fù)雜水平。因此，盡管與現(xiàn)有技術(shù)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶具有共同的一些特征，即，其中超過(guò)80％的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶分子和同源物具有以ELVP開(kāi)始的相同N-端，并具有與下文中所列的SEQ?ID?NO：180％相同或相對(duì)于SEQ?ID?NO：1僅含有1-5個(gè)保守性置換的序列，但本發(fā)明的I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶具有增強(qiáng)的半衰期以及特征在于較高的下述比例的糖基化模式：
甘露糖5+甘露糖8+G2FS2/甘露糖6+甘露糖7+G2FS1。
具體地，如以下實(shí)施例中所示，延遲添加谷氨酰胺至培養(yǎng)基中直至第一天培養(yǎng)后導(dǎo)致結(jié)果的顯著改善。
本發(fā)明的I-EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶可以以與現(xiàn)有技術(shù)的EN-腺苷三磷酸雙磷酸酶相似的方式用于治療與炎癥和血栓形成相關(guān)的病癥。盡管現(xiàn)有技術(shù)中詳細(xì)描述了這些用途，但為了閱讀者的方便，將其概述如下：
用途
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