[發明專利]中華鱉胚胎細胞組織塊的原代培養方法

有效

• 申請號: 201410171766.6
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN104059875A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 曹錚;劉莉;林鋒;葉雪平
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，特別涉及一種中華鱉胚胎細胞組織塊的原代培養方法。

背景技術

中華鱉，又名水魚、甲魚、團魚，是常見的養殖龜種。中華鱉生活于江河、湖沼、池塘、水庫等水流平緩、魚蝦繁生的淡水水域，也常出沒于大山溪中。在安靜、清潔、陽光充足的水岸邊活動較頻繁，有時上岸但不能離水源太遠。能在陸地上爬行、攀登，也能在水中自由游泳。喜曬太陽或乘涼風。民間諺語形容鱉的活動是“春天發水走上灘，夏日炎炎柳蔭棲，秋天涼了入水底，冬季嚴寒鉆泥潭”。夏季有曬甲習慣，寒冷的冬季會冬眠，翌年開始蘇醒尋食。喜食魚蝦、昆蟲等，也食水草、谷類等植物性食物，并特別嗜食臭魚、爛蝦等腐食，耐饑餓，但貪食且殘忍，如食餌缺乏還會互相殘食。性怯懦怕聲響，白天潛伏水中或淤泥中，夜間出水覓食。

中華鱉是國內主要的淡水養殖品種，國內第一個淡水魚類細胞系ZC-7901由張念慈楊廣智（1981）發表在水產學報上。以后有不少淡水魚類細胞系的建立。而中華鱉細胞體外培養也有報道。其中吳康，薛明強等（2000）發表在中國水產科學，中華鱉胚胎細胞體外培養的研究；李曉莉，曾令兵等（2010）發表在水生態學雜志上的中華鱉5種組織細胞的離體培養實驗。上述方法存在操作復雜，條件較苛刻，培養成功率較低的不足。

發明內容

本發明的目的在于提供一種一種中華鱉胚胎細胞組織塊的原代培養方法，操作簡單，培養方便，無需特定的細胞分離液，培養成功率高。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種中華鱉胚胎細胞組織塊的原代培養方法，所述原代培養方法包括以下步驟：

（1）采集中華鱉的受精蛋，受精蛋表面用質量濃度70-75%酒精噴灑消毒。

（2）破開受精蛋的蛋殼，將胚胎從蛋黃中剝離出來，將剝離出來的胚胎組織放在1×PBS緩沖液中清洗，然后在質量濃度70-75%酒精中第一次浸泡滅菌，接著在另一質量濃度70-75%酒精中第二次浸泡滅菌。

第一次浸泡滅菌時，胚胎組織還含少量PBS液，第二次浸泡滅菌時PBS已經幾乎沒有了，這樣胚胎組織滅菌更徹底。

（3）將胚胎組織放入M199培養基中清洗4-5次，然后轉移至完全培養基中并將胚胎組織剪碎得組織塊，再將組織塊用完全培養基清洗一次。將胚胎組織放入M199培養基中清洗4-5次目的是把結締組織、血塊、血絲等雜物去掉，同時還具有殺菌作用。

（4）用無菌的一次性接種針均勻分散組織塊于細胞瓶的內壁上，使組織塊貼壁生長3-4小時，然后加入完全培養基浸沒組織塊，30-31℃恒溫培養3天以上。本發明采用一次性接種針（滅菌）分散組織塊可以有效、方便地均勻分散組織塊，能高效促進細胞貼壁生長，實用性非常高。

本發明先不讓完全培養基浸沒組織塊，而是讓組織塊能貼壁生長幾小時后再進行，如果一開始就讓完全培養基浸沒組織塊的話，組織塊就不能貼壁生長，也就不能獲得貼壁細胞。

作為優選，步驟（1）中所述受精蛋為孵化15-25天的受精蛋。此時受精蛋重量為3.5-5克，外部器官剛開始形成，細胞還未完全分化，細胞容易生長，培養的成功率高。

作為優選，步驟（2）中1×PBS緩沖液的PH為7.4，其中加入有500U/ml青霉素和500U/ml鏈霉素。

作為優選，步驟（2）中第一次浸泡滅菌和第二次浸泡滅菌的時間均為10-15秒。

作為優選，步驟（3）中M199培養基中加入有500U/ml青霉素和500U/ml鏈霉素。

作為優選，步驟（3）中完全培養基為在M199培養基中加入100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、20％胎牛血清以及2mmol/L谷氨酰氨。

本發明的有益效果是：本發明建立了中華鱉胚胎組織的原代細胞的培養方法，操作簡單，培養方便，無需特定的細胞分離液，培養成功率高。用一次性接種針分散組織塊可以有效、方便地均勻分散組織塊，能高效促進細胞貼壁生長，實用性非常高。可推廣應用于幾乎所有的水產類組織原代培養。

附圖說明

圖1是中華鱉孵化19天的受精蛋。

圖2是破開受精蛋蛋殼露出的胚胎。

圖3是組織塊均勻分散組織塊于細胞瓶內壁的示意圖。

圖4是生長3天的胚胎原代組織細胞的顯微視圖。

圖中：1、胚胎，2、組織塊。

具體實施方式

下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。