[發(fā)明專(zhuān)利]低濃度半胱氨酸介導(dǎo)形成的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯紅色衍生物的制備方法

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2014-04-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923053A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高麗萍;孟菲;劉亞軍;戴前穎;蔣曉嵐;夏濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07D311/62
• 分類(lèi)號(hào): C07D311/62
• 代理公司: 合肥金安專(zhuān)利事務(wù)所 34114
• 代理人: 金惠貞

1.低濃度半胱氨酸介導(dǎo)形成的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯紅色衍生物的制備方法，其特征在于：將一定濃度的反應(yīng)底物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、反應(yīng)介質(zhì)半胱氨酸和反應(yīng)緩沖液磷酸緩沖液混合均勻，在溫度為80℃條件下，水浴加熱3小時(shí)，得到EGCG紅色衍生物的反應(yīng)液；所述紅色衍生物的反應(yīng)液經(jīng)過(guò)HPD400大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行初步純化、反相C18-OPN層析柱再純化，冷凍干燥后，得到紅色衍生物純品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低濃度半胱氨酸介導(dǎo)形成的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯紅色衍生物的制備方法，其特征在于具體的制備操作步驟如下：

（1）制備紅色衍生物的反應(yīng)液

將濃度為2毫摩爾的pH6.0的磷酸緩沖液3.2升、濃度為1.0克/升的半胱氨酸0.4升和濃度為15克/升的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）溶液0.4升混合均勻，在溫度80℃條件下，水浴反應(yīng)3小時(shí)，得到4升紅色衍生物反應(yīng)液；其中EGCG為反應(yīng)底物，半胱氨酸為反應(yīng)介質(zhì)，磷酸緩沖液為反應(yīng)緩沖液；

（2）初步純化

將4升紅色衍生物反應(yīng)液，上HPD400大孔樹(shù)脂層析柱吸附，用3倍柱體積的超純水洗脫，除去半胱氨酸，棄去洗脫液；用3倍柱體積的30%乙醇洗脫，除去大孔樹(shù)脂中殘留的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，棄去洗脫液；再用1倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集洗脫液；將乙醇洗脫液在溫度40℃條件下，得到濃縮液；將濃縮液在-80℃條件下冷凍干燥，得到紅色粉末Ⅰ；

（3）再純化

將紅色粉末Ⅰ溶于20毫升的10%甲醇中，上反相C18-OPN層析柱吸附；先用3倍柱體積的30%甲醇洗脫，棄去洗脫液；再用3倍柱體積的50%甲醇洗脫，棄去洗脫液；最后用1倍柱體積的純甲醇洗脫，收集紅色甲醇洗脫液；將紅色甲醇洗脫液在溫度40℃條件下，減壓濃縮去除溶液中的甲醇，得到濃縮液；

（4）冷凍干燥：將濃縮液在-80℃條件下，冷凍干燥，得到紅色粉末Ⅱ，即為EGCG紅色衍生物；

（5）EGCG紅色衍生物的物化性質(zhì)：所述EGCG紅色衍生物為固體粉末狀；

溶解特性：溶于甲醇、乙醇，含水甲醇，溶于熱水，不溶于冷水；

紫外可見(jiàn)光譜特性：紫外光譜區(qū)的吸收峰為220、278nm，可見(jiàn)光譜區(qū)的特征吸收峰為500nm；

質(zhì)譜特性：在ESI-MS的負(fù)離子模式下，出現(xiàn)的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]^-?為964；碎片離子峰為524.1、356.0、311.9、676.0，提示紅色衍生物為含有N原子的EGCG二聚物；

紅外特性：與底物EGCG相比，在羥基的伸縮振動(dòng)吸收區(qū)域（3381cm^-1）變寬了，彎曲振動(dòng)（1340-1420?cm^-1）減弱了，提示該紅色衍生物含有的羥基官能團(tuán)增加了；與底物EGCG相比，在2924?cm^-1、2958?cm^-1、2854?cm^-1處出現(xiàn)弱吸收峰，缺少羰基基團(tuán)的1697?cm^-1信號(hào)峰，提示紅色衍生物缺少?zèng)]食子酰基基團(tuán)，或沒(méi)食子?；鶊F(tuán)發(fā)生了衍生化反應(yīng)；

核磁共振氫譜特性：與底物EGCG相比，在低場(chǎng)區(qū)，δ=7.07ppm信號(hào)減弱，增加了δ=7.7ppm信號(hào)，推測(cè)沒(méi)食子基團(tuán)已經(jīng)發(fā)生了變化；在高場(chǎng)區(qū)，增加了δ=1.34ppm信號(hào)，提示含有N-H信號(hào)；在δ=2.99ppm和2.89ppm的4α-H和4β-H信號(hào)變?nèi)趿?，并出現(xiàn)了δ=4.59ppm信號(hào)，提示在4α-H和4β-H位置上發(fā)生了聚合；位于δ=6-7?ppm之間的6-H、8-H、2′-H、6′-H的信號(hào)峰變寬了，且有裂分，提示紅色衍生物為聚合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低濃度半胱氨酸介導(dǎo)形成的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯紅色衍生物的制備方法，其特征在于：步驟（1）所述的磷酸緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。