[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)氨酶及其在合成西他列汀中間體中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410169882.4
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN105018440B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅煜;丁時澄;瞿旭東
• 申請（專利權(quán)）人: 上海弈柯萊生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12P17/18
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 于永進

本發(fā)明提供了一種新的轉(zhuǎn)氨酶及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，該重組酶及其制備方法，以及該轉(zhuǎn)氨酶在對羰基化合物不對稱轉(zhuǎn)氨制備活性手性胺中的應(yīng)用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)氨酶來源于分支桿菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR?1，應(yīng)用于(R)?3?氨基?4?(2,4,5?三氟苯基)?丁酸甲酯的制備。與其他制備方法相比，本方法催化制備的產(chǎn)物濃度高，對映選擇性強，反應(yīng)條件溫和，操作簡便，易于放大等優(yōu)勢，因此在西他列汀磷酸鹽的生產(chǎn)中具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)氨酶，含有該酶編碼基因的重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，表達的重組酶和該重組酶的制備方法，以及該轉(zhuǎn)氨酶作為催化劑在不對稱合成西他列汀中間體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖尿病是由于胰島素分泌改變，導(dǎo)致胰島素缺乏及作用減弱，或者胰島素活性降低，或者在兩者共同影響下，出現(xiàn)的代謝性疾病，以高血糖為特征，并同時伴有蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝紊亂。糖尿病及其并發(fā)癥對人類健康的危害程度居心血管疾病、腫瘤之后的第三位，成為危害人類健康的重要疾病。國際糖尿病聯(lián)合會預(yù)計，到2030年，患病總?cè)藬?shù)將超過4.35億人。而我國已成為世界糖尿病患病率增長速度最快的國家之一，目前約有4000萬糖尿病患者，人數(shù)僅次于印度，居世界第二位。在糖尿病的四種類型中，II型糖尿病占90％以上，多見于30歲以上的中老年人，病因主要是由于機體對胰島素不敏感。在臨床上治療II型糖尿病的藥物中，磺酰脲類胰島素分泌促進劑、雙胍類胰島素敏感性增強劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類胰島素增敏劑、非磺酰脲類胰島素分泌促進劑等雖然降糖作用較為理想，但均有一定的副作用影響患者堅持用藥，達不到較好的血糖控制效果。西他列汀磷酸鹽(Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批準上市的第一個二肽基酶-IV(DPP-4)抑制劑，用于治療II型糖尿病，其單用或與二甲雙胍、吡格列酮合用都有明顯的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反應(yīng)少。它主要通過抑制DPP-4對胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)的降解以達到治療的目的，輕度增加GLP-1含量并減弱GLP-1代謝物的拮抗作用，所以在有效發(fā)揮降糖作用的同時不會引起因GLP-1含量過高而引起的惡心嘔吐等副作用；同時，GIP促進胰島素分泌具有血糖依賴性，故能大大降低口服降糖藥導(dǎo)致的低血糖副作用的發(fā)生率。西他列汀磷酸鹽由默克公司開發(fā)，于2006年8月及10月分別被墨西哥衛(wèi)生部及美國FDA批準為治療II型糖尿病的藥物，商品名為捷諾維(Januvia)，目前已經(jīng)在全世界60多個國家批準使用，2012年銷售額已達40.86億美元，同比增長23％。因此，西他列汀磷酸鹽是屬于國際最新且附加值極高的“重磅炸彈”。

西他列汀合成中的關(guān)鍵步驟是手性氨基中間體的構(gòu)建。美國專利US6699871公開了一種西他列汀的合成方法，采用手性源來誘導(dǎo)出手性的α-氨基酸，而后通過重氮化反應(yīng)產(chǎn)生β-氨基酸來構(gòu)建所需的手性中心。該路線所需的原料成本相對較高，反應(yīng)較為麻煩，且產(chǎn)業(yè)化過程中工藝過程和產(chǎn)品質(zhì)量都難以控制。

國際專利WO2004087650公開了默克公司關(guān)于西他列汀的合成路線，利用手性釕催化劑對酮進行不對稱氫化構(gòu)建手性醇，然后將手性醇轉(zhuǎn)化成手性胺。該合成方法中，需要用到釕催化的不對稱氫化，催化劑價格昂貴，總收率只有52％，工藝中用到高壓氫氣，立體選擇性也不高。

國際專利WO2005003135公開了默克公司開發(fā)的西他列汀的合成方法，以S-苯甘氨酰胺作為手性助劑來誘導(dǎo)催化氫化而合成手性胺。該路線需要兩次催化氫化，第一次所用的鉑催化劑價格昂貴，第二次脫保護時需要用大量的Pd(OH)₂-C催化劑，成本較高，ee值為96％，需要進一步重結(jié)晶。

國際專利WO2007050485公開了默克公司關(guān)于西他列汀的合成方法，采用了手性銠催化劑對烯胺的不對稱氫化來合成手性胺，產(chǎn)率達到84％，ee值94％，但該方法需要用昂貴的銠手性催化劑，去除與回收也較為困難。