[發明專利]一種環化活力提高的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體

有效

• 申請號: 201410169712.6
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN103966190A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 顧正彪;李兆豐;黃敏;李才明;洪雁;程力
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/28
• 分類號: C12N9/28;C12N15/56;C12N15/75;C12P19/18
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種環糊精葡萄糖基轉移酶突變體，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第32位的天冬酰胺分別突變為精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、賴氨酸或谷氨酰胺。

2.編碼權利要求1所述突變體的核苷酸序列。

3.含有權利要求2所述核苷酸序列的載體或細胞。

4.一種獲得權利要求1所述突變體的方法，根據SEQ ID NO.1所示的基因序列，分別設計并合成定點突變引物，對基因進行定點突變，獲得編碼N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q突變體的基因，并在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600中進行表達。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述定點突變引物分別是：

引入Asn32Arg突變的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCAGAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTCTGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Lys突變的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCAAAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTTTGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32His突變的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCCATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTATGGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Glu突變的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCGAAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTTCGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Asp突變的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCGATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTATCGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Gln突變的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCCAAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTTGGGCGGGATTGC-3’。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含突變質粒的表達宿主B.subtilis WB600的單克隆于含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的LB培養基中，在37℃、200r/min下培養8～12h，以體積比4％的接種量接種到含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的TB培養基中，在37℃、200r/min下發酵48h；將發酵液于4℃、10000rpm離心20min以除去菌體，收集上清液并純化，分別得到突變體N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q。

7.一種提高環糊精葡萄糖基轉移酶環化能力的方法，是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CGTase的第32位天冬氨酸分別突變為精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、賴氨酸或谷氨酰胺。

8.權利要求1所述環糊精葡萄糖基轉移酶突變體在環糊精生產中的應用。