[發明專利]抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201410169608.7
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN104004712A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 張鴻聲;張艷磊;羅曉玲;王宇環
• 申請（專利權）人: 深圳市合一康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/10;C12N15/867
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其是涉及一種新的多抗原廣譜CTL的制備方法和應用。?

背景技術

目前，癌癥的抗腫瘤免疫治療策略主要有：腫瘤全細胞疫苗(Whole-tumor?cell?vaccines)、樹突狀細胞疫苗(Dendritic?cell?vaccines,DC疫苗)、重組蛋白疫苗(recombinant?proteins?vaccines)、多肽疫苗(Peptide?vaccines)、DNA疫苗(DNA?vaccines)和病毒疫苗(Viral?vaccines)等，有研究顯示，以DC疫苗聯合過繼性T細胞免疫治療(adoptive?T-cell?therapy)效果最好。DC是目前發現的功能最強大的專職抗原遞呈細胞，成熟DC表面高表達MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)和黏附分子(LFA-3、ICAM-1等)，不僅能有效的將腫瘤抗原遞呈給已活化或記憶性T細胞，還能將抗原遞呈給初始T細胞使其增殖，是機體適應性T細胞免疫應答的始動者，在適應性T細胞免疫應答的誘導中具有獨特的地位。目前，以DC為基礎的CTL主要包括：腫瘤抗原肽致敏的CTL、腫瘤全細胞抗原致敏的CTL、腫瘤抗原基因轉導的CTL等。其中，用腫瘤抗原肽或腫瘤全細胞抗原致敏DC回輸后，雖然可以引起特異免疫保護作用，但并不持久；然而有意義的是，從有限的腫瘤組織中擴增足量的有效刺激DC的mRNA，采用差異篩選方法獲特異性表達的腫瘤特異性抗原mRNA導入DC，制備RNA疫苗，或將腫瘤抗原基因以裸DNA方式導人DC，或以病毒為載體轉導DC，使DC持續表達腫瘤抗原，可解決上述兩種CTL因抗原解離、腫瘤來源有限、有誘發自身免疫性疾病危險等不足的問題。?

目前基因修飾DC的方法主要有病毒載體和非病毒載體介導兩大類方法。非病毒載體介導的方法主要有脂質轉導、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法等。脂質體轉導作為早期的方法之一近年來雖然不斷改進，但其轉導效率不高和細胞毒性?仍是其廣泛應用的障礙，同時對DC的功能及活性也有較大的影響。現認為病毒載體對DC的轉導更為有效。如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒等。腺病毒載體轉基因效率高，不受靶細胞是否為分裂細胞的限制，容易制得高滴度病毒載體，生物活性評價也較簡便，但由于有較高的免疫原性，導致其使用受限。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型的廣譜腫瘤抗原特異性的CTL，使用慢病毒載體細胞基因工程的方法，利用樹突狀細胞強大的抗原遞呈功能，更有效的激活廣譜腫瘤抗原特異性T淋巴細胞的增殖和殺傷能力。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

一種CTL的制備方法，包括步驟：?

A)攜帶腫瘤抗原基因重組載體的構建；?

B)DC細胞的分離與培養；?

C)使用步驟A)所述重組載體轉導步驟B)所述的未成熟DC細胞；?

D)進一步通過細胞因子誘導步驟C)所述的未成熟DC細胞成為成熟DC細胞；?

E)將步驟D)所述的成熟DC細胞與T淋巴細胞共培養，獲得具有抗原特異性的殺傷毒T淋巴細胞，即CTL。?

所述的腫瘤抗原基因為新構建的癌胚抗原(CEA)基因片段，或黑色素瘤相關抗原A3(MAGE-A3)基因片段，或粘蛋白1抗原(MUC1)基因片段；本發明通過大量的篩選和探索，最終確定出癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；黑色素瘤相關抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；粘蛋白1抗原基因片段如SEQ?ID?NO:3所示，使得最終制備得來的CTL具有極佳的抗原特異性。?

在采用血細胞分離儀或直接抽取腫瘤患者靜脈外周血(50-150毫升)，分離出外周血單個核細胞(PBMC)。經培養，PBMC被分離為淋巴細胞和單核細胞，淋巴細胞繼續培養，備用。攜帶特定腫瘤相關抗原決定簇基因的慢病毒載體感?染未成熟的單核細胞來源的未成熟DC細胞，并以細胞因子TNF-α誘導成熟的樹突狀細胞(DC)產生。將成熟的DC與T淋巴細胞混合培養，使淋巴細胞誘導成為具有抗原特異性的，殺傷抗原陽性腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，最后將被激活的CTL回輸給腫瘤患者。整個過程需要12-14天。?

本發明優選為同時轉導可用于表達CEA、MAGE-A3、MUC1三種廣譜腫瘤抗原的慢病毒混合載體轉導未成熟DC細胞，獲得經活化和增殖的腫瘤抗原特異性的T細胞(Lv-DC-CTL)，以達到更大的廣譜腫瘤治療范圍和針對多靶點抗原誘導，增強特異腫瘤殺傷性的治療效果。?