[發明專利]抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 201410169309.3
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN103910795A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 景宏麗;王娜;張旻;林祥梅;吳紹強
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明屬于免疫學領域，具體涉及一種抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體，雜交瘤細胞株，及其應用。

背景技術

玻勒虹彩病毒(Bohle?virus,BIV)屬于虹彩病毒科蛙病毒屬的確定成員。蛙病毒屬以蛙病毒3型(FV3)為代表種，確定成員除了玻勒虹彩病毒(Bohle?virus,BIV)外還有歐鮰病毒(European?catfish?virus,ECV)、歐鲇病毒(European?sheatfish?virus,ESV)和桑蒂庫帕蛙病毒(Santee-Cooper?ranavirus)等。蛙病毒的病毒顆粒較大(150～180nm)，呈二十面體立體對稱?；蚪M為150～170kb的雙鏈DNA，在胞核和胞質中均可進行復制。

該病毒的宿主范圍很廣泛，包括魚類、兩棲類、爬行類和一些易感染的其他動物種類。為了及時防止在水環境中玻勒虹彩病毒危害性的擴大，需要進一步了解其宿主的范圍，這就要求盡快發展一種有效的檢測技術。

目前，病毒分離和PCR方法是應用于玻勒虹彩病毒診斷的常用方法。但病毒分離法耗時較長，不易作為快速診斷；PCR方法，雖然用時較短，但是成本較高，不易作為大規模調查。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體、應用該單克隆抗體的檢測玻勒虹彩病毒的ELISA試劑盒，以及體外檢測玻勒虹彩病毒的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用下述技術方案：

本發明所提供的抗玻勒虹彩病毒的單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCNo.8555的雜交瘤細胞株分泌產生的。該小鼠雜交瘤細胞株已于2013年12月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，其保藏編號為CGMCC?No.8555，分類命名為玻勒虹彩病毒的雜交瘤細胞株。

保藏編號為CGMCC?No.8555的小鼠雜交瘤細胞株也屬于本發明的保護范圍。

本發明還提供了一種檢測玻勒虹彩病毒的ELISA試劑盒，該試劑盒包括已包被本發明所述的單克隆抗體的固相載體。優選地，還包括羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體，和酶標抗羊的抗體。所述酶為辣根過氧化酶。

本發明采用商業化購買的酶標抗羊的抗體，是因為一方面，若標記本發明中表述的單克隆抗體或者是多克隆抗體，過程比較復雜。即使成功，都可能影響抗體的效價或者抗體的其他方面，使整個試劑盒研發更加繁瑣，耗力，耗時。而應用商業化酶標抗羊的抗體，則不存在這個問題；另一方面，若標記本發明中的單克隆抗體或者是多克隆抗體，整個試劑盒的成本費用就很高，對于試劑盒推廣應用是不可行的。應用商業化酶標抗羊的抗體(sigma)，每1ml費用是1000元左右，降低了試劑盒的成本。

進一步地，為了便于檢測，本發明試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，以及ELISA反應所需的酶聯免疫檢測試劑。其中，所述陽性對照為玻勒虹彩病毒溶液，陰性對照為魚類細胞懸液或者是正常組織勻漿液。所述酶聯免疫檢測試劑，均為常規的酶聯免疫檢測試劑，包括但不限于，酶的底物反應液、洗滌液和反應終止液。

本發明所述的羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體的制備過程如下：用玻勒虹彩病毒作為抗原，多點注射免疫山羊，分別是每1周免疫一次，共免疫4次，取血清，即為羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體。

本發明還提供了一種檢測玻勒虹彩病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)將待測樣品加樣于包被有權利要求1所述的單克隆抗體的固相載體；

(2)將羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗體加樣于步驟(1)獲得的固相載體；

(3)將酶標抗羊的抗體加樣于步驟(2)獲得的固相載體；

(4)檢測酶標記物，確定待測樣品中玻勒虹彩病毒的存在與否或存在的量，從而確定玻勒虹彩病毒的存在與否。

本發明的有益效果如下：

1.分泌本發明所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株增殖后可制備大量所需的特異抗體。雜交瘤細胞注射小鼠后，產生的腹水單抗ELISA效價為1:1×10⁶。雜交瘤細胞株活性高，液氮中凍存8-10個月后，仍能快速復蘇并保持良好活性。在所述的單克隆抗體的制備中，細胞融合率為97.6％，陽性率為98.0％。

2.免疫小鼠的抗原是根據免疫耐受的原理，以簡單的差速離心方法粗提純濃縮的病毒懸液作為免疫原，免疫小鼠。該免疫方法經多次實驗數據已證實其主要優勢是即保證了細胞融合后的陽性效果，又簡化了抗原的制備方法。