[發明專利]抑制人細胞分裂周期蛋白42基因表達和增殖的miRNA模擬物及其表達載體和應用

在審

• 申請號: 201410169244.2
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN103898117A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 王金環;王瓊;張飚;尚超;王辰;杜春發
• 申請（專利權）人: 天津市環湖醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術領域

本發明涉及生物工程技術，特別是一種抑制人細胞分裂周期蛋白42基因表達和增殖的miRNA模擬物及其表達載體和應用。?

背景技術

Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，具有GTP酶活性。CDC42全稱為細胞分裂周期蛋白42，其基因定位于1p36.1，是Rho家族中的代表成員，其在腫瘤發生發展中具有重要作用。國內外研究證實，細胞分裂周期蛋白42反義寡核苷酸可以在體外抑制膠質瘤細胞的增殖，但該技術也存在轉染效率低，作用時間短的不足，使其抑瘤作用受到限制，另外，人工合成寡核苷酸的費用昂貴，也使該技術的應用遇到技術困難。?

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20~25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生的，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced?silencing?complex,RISC），通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。miRNA?模擬物是模擬生物體內源的miRNAs，運用化學合成的方法合成，能增強內源性miRNA的功能近年來人工合成的miRNA（artificial?miRNA，amiRNA）已經成功應用于沉默預期靶基因的表達及其功能研究，人工合成的miRNAs既能夠特異性地沉默單一基因，也可以同時沉默多個相關但不相同的基因。miRNA?模擬物進一步增強內源miRNA的沉默作用，降低細胞內蛋白表達量，進行功能獲得性（gain-of-function）研究；相反，使用化學合成的方法合成miRNA?inhibitors，特異的靶向和敲除單個的miRNA分子，可以削弱內源miRNA的基因沉默效應，提高蛋白表達量，進行功能缺失性（loss-of-function）研究，可以用來篩選miRNA靶位點，篩選調控某一基因表達的miRNA，篩選影響細胞發育過程的miRNA。化學合成miRNA?模擬物和inhibitors是近年來研究的一個新熱點，已經成為研究動植物基因家族功能的有用工具，并有望成為癌癥治療和臨床研究的一種新策略。?

從miRNA?模擬物的作用機制中可見，這種基因表達調控方法屬于轉錄后的調節并具有明顯優勢：miRNA?模擬物基因抑制效果確切，應用微量的模擬物即可使其編碼致病基因產物的含量下降90%以上、甚至可以達到基因敲除的效果；其次,?miRNA?模擬物?抑制具有嚴格的序列特異性，治療的針對性強，因而應用此項技術能夠同時抑制同一基因的多個靶點或多個不同基因而不致相互干擾；?同時，RNAi的作用具有級聯式放大效應和高穿透性更適合惡性腫瘤的實驗研究；此外，RNAi序列識別的特異性即或對由野生型點突變形成的癌基因也能夠產生準確有效的封閉效果而對細胞分裂周期蛋白42野生型基因沒有影響。在對多種腫瘤細胞系實驗中也證實：腫瘤細胞中均存在著RNAi的機制，化學合成、質粒/病毒或其他方式介導的RNAi可以有效地抑制內源性RNA的表達。?

發明內容

本發明就是為了解決膠質瘤等腫瘤基因治療問題，以RNA干擾機制為基礎，通過人工合成或表達質粒序列轉錄形成的小雙鏈miRNA模擬體可以靶向作用于細胞分裂周期蛋白42基因的mRNA，從而阻斷其翻譯過程，達到使細胞分裂周期蛋白42基因表達降低的結果，而提供一種抑制人細胞分裂周期蛋白42基因表達和增殖的miRNA模擬物及其表達載體和應用。??

本發明以RNA干擾技術為基礎，從microrna數據庫中中獲得能夠與細胞分裂周期蛋白42mRNA?3’UTR區域結合的miRNA，選擇其中參考分值較高的miR-139-5P針對細胞分裂周期蛋白42基因設計了1條長度為19個核苷酸的miRNA?模擬物（見表1）（由上海吉瑪公司合成）。通過一系列體外實驗證實（實施例1），該模擬體對細胞分裂周期蛋白42的抑制效果最好。將miR-139-5p序列設計ShRNA正義鏈和反義鏈，以loop環相連，稱為ShRNA。合成每條ShRNA的DNA模板的兩條單鏈，兩條單鏈DNA退火即為DNA雙鏈模板（ShDNA?Sense: