[發(fā)明專(zhuān)利]生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410168615.5
• 申請(qǐng)日: 2014-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103952424B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹熙俊;金奭中;金進(jìn)秀;康錦丹
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 尹熙俊
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/63
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/63;C12N5/073;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 北京青松知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11384
• 代理人: 鄭青松

1.一種敲除MSTN雙側(cè)基因的TALENs基因表達(dá)盒，其特征在于，包含SEQ.NO.1～2所示的核酸序列。

2.權(quán)利要求1所述TALENs基因表達(dá)盒在生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。

3.一種敲除MSTN雙側(cè)基因的TALENs質(zhì)粒，其特征在于，包含用以切割MSTN基因特異位點(diǎn)而形成上述基因表達(dá)盒的TALENs質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的TALENs質(zhì)粒，其特征在于，與所述質(zhì)粒相應(yīng)的NCBI基因編號(hào)為399534；基因組序列號(hào)為NC_010457.3。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的TALENs質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的作用靶位點(diǎn)位于MSTN基因第一外顯子特定序列，該特定序列如SEQ.NO.3所示。

6.權(quán)利要求3或4所述TALENs質(zhì)粒在生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。

7.利用權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述TALENs基因表達(dá)盒或權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)所述的TALENs質(zhì)粒構(gòu)建的MSTN基因敲除陽(yáng)性細(xì)胞系。

8.權(quán)利要求7所述MSTN基因敲除陽(yáng)性細(xì)胞系在生產(chǎn)雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬中的應(yīng)用。

9.一種生產(chǎn)MSTN雙側(cè)基因敲除的雙肌性狀體細(xì)胞克隆豬的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提供權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)所述的TALENs質(zhì)粒，其作用靶位點(diǎn)位于MSTN基因第一外顯子的特定序列，該特定序列如SEQ.NO.3所示；

(2)提供豬胎兒成纖維細(xì)胞，并通過(guò)電轉(zhuǎn)染法以所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，再分選出其中的陽(yáng)性細(xì)胞作為供體細(xì)胞，且利用化學(xué)輔助去核方法去核后進(jìn)行體細(xì)胞核移植；

(3)經(jīng)胚胎移植確定妊娠后26-36天取出胎兒建立胎兒成纖維細(xì)胞后進(jìn)行基因測(cè)序；

(4)以步驟(2)所獲MSTN雙側(cè)基因敲除胎兒細(xì)胞作為供體細(xì)胞再次體細(xì)胞核移植，實(shí)現(xiàn)胚胎移植；

(4)足月分娩后免疫組化及形態(tài)學(xué)觀察，確定為雙肌性狀克隆豬；

(5)利用步驟(4)所獲MSTN雙側(cè)敲除的雙肌性狀克隆公豬，取精液對(duì)發(fā)情母豬進(jìn)行人工受精，進(jìn)而批量生產(chǎn)雙肌豬。