[發(fā)明專利]一種生物合成腺苷蛋氨酸的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410163487.5
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN103993055A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱家榮;鄭計(jì)瑞;陳麗芬;楊善巖
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12R1/865;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種腺苷蛋氨酸的合成方法，特別涉及利益工程菌進(jìn)行生物合成腺苷蛋氨酸的合成方法。

(二)背景技術(shù)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)又名S-腺苷甲硫氨酸，在生物體內(nèi)主要起著轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫和轉(zhuǎn)氨丙基的作用，參與眾多重要的生化反應(yīng)，從而具有多種治療作用，對抑郁癥、關(guān)節(jié)炎、肝膽疾病、胰腺炎等均有較好療效。在歐洲一直將其作為憂郁癥和關(guān)節(jié)炎的處方治療藥物。從1999年美國FDA批準(zhǔn)其作為食品營養(yǎng)補(bǔ)充劑上市到現(xiàn)在，SAM的功效已經(jīng)逐漸為大眾了解。由于生產(chǎn)技術(shù)水平所限，目前SAM的價(jià)格還比較昂貴，因此研究開發(fā)低成本的SAM生產(chǎn)技術(shù)仍然具有現(xiàn)實(shí)意義。

由于SAM結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成法原料價(jià)格昂貴、合成困難，因此國內(nèi)外的合成研究和實(shí)際生產(chǎn)都集中在生物合成方法。生物合成SAM主要有兩類方法：一類是采用添加蛋氨酸的發(fā)酵法；另一種是采用腺苷、腺苷三磷酸(ATP)等和蛋氨酸兩種前體物的轉(zhuǎn)化合成法。

在轉(zhuǎn)化合成法中，發(fā)明專利CN1217002C(2005.08.31)、CN101285085B(2011.04.27)等公開了一種采用克隆了SAM合成酶的大腸桿菌工程菌，將ATP和蛋氨酸兩種前體物轉(zhuǎn)化合成SAM的方法；發(fā)明專利CN100363499C(2008.01.23)公開了一種采用ATP合成菌種，以腺苷合成分泌ATP，并添加蛋氨酸和SAM合成酶，偶聯(lián)轉(zhuǎn)化合成SAM的方法。

采用腺嘌呤合成ATP已經(jīng)有許多報(bào)道(Akihiko?Maruyama?and?Tatsuro?Fujlo.Biosci.Biotechnol.Biochem.2001,65(3):644-650)，腺嘌呤比ATP和腺苷的相對分子量都小，采用腺嘌呤合成SAM，在相同分子轉(zhuǎn)化率情況下，相同重量的腺嘌呤可以產(chǎn)生較多SAM，而且腺嘌呤的價(jià)格也較低，因此采用腺嘌呤合成ATP進(jìn)而合成SAM，有望進(jìn)一步降低SAM生產(chǎn)成本。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種利用ATP合成菌種構(gòu)建的SAM工程菌，以腺嘌呤和蛋氨酸等原料轉(zhuǎn)化合成腺苷蛋氨酸的方法，使該工程菌用腺嘌呤大量合成ATP的同時(shí)，高效轉(zhuǎn)化合成分泌腺苷蛋氨酸的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種生物合成腺苷蛋氨酸的方法，所述方法為：將SAM工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液過濾，取濕菌體在60-65℃干燥2-3h進(jìn)行活化處理，獲得活化菌體，活化菌體加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸鹽、硫酸鹽、蛋氨酸和水構(gòu)成反應(yīng)體系，在33～37℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得的反應(yīng)液即為含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反應(yīng)體系中活化菌體的用量為70～100g/L(即終濃度)，腺嘌呤的用量為2～4g/L(終濃度)、葡萄糖的用量為80～100g/L(終濃度)，磷酸鹽的用量為70～90g/L(終濃度)，硫酸鹽的用量為3～5g/L(終濃度)，蛋氨酸的用量為3～5g/L(終濃度)；

所述SAM工程菌是指將釀酒酵母(Saceharomuces?cerevisiae)的SAM合成酶基因2(sam2)克隆至雅致放射毛霉(Actinomucor?elegans)ZGB1中，構(gòu)建的腺苷蛋氨酸工程菌，即SAM工程菌。具體，本發(fā)明采用SAM工程菌是選用能夠大量合成ATP菌種為SAM工程菌的出發(fā)菌株，具體選用從腺嘌呤大量合成分泌ATP的雅致放射毛霉(Actinomucor?elegans)ZGB1(詳見專利CN102154117A)為出發(fā)菌株；再選用SAM合成酶基因，具體選用基因數(shù)據(jù)庫GeneBank所公布的釀酒酵母(Saceharomuces?cerevisiae)來源的SAM合成酶基因2(sam2，登陸號M23368)，依其序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增得到sam2；然后將sam2裝配入重組質(zhì)粒pCB1004-PgpdA(詳見專利CN1285721C)，得到由強(qiáng)啟動(dòng)子PgpdA驅(qū)動(dòng)的sam2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pCB1004-PgpdA-sam2，將pCB1004-PgpdA-sam2線性化，轉(zhuǎn)化上述雅致放射毛霉ZGB1菌株，篩選驗(yàn)證得到SAM工程菌。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述磷酸鹽為磷酸氫二鉀或磷酸氫二鈉。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述硫酸鹽為硫酸鎂。