[發明專利]一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法

在審

• 申請號: 201410162213.4
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN103940795A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 張立欽;童森淼;陳安良;胡加付;馬建義;王勇軍;毛勝鳳;劉洪波;張紹勇
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.?一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于包括以下步驟：

1）按重量百分比稱取喜樹堿原藥0.1-1.5%，氫氧化鈉2-9%，水89-98%，反應溫度控制在45-65℃下不斷攪拌至完全溶解，配制成喜樹堿溶液，備用；

2）將步驟1）中的喜樹堿溶液稀釋至900-1200倍，取1-5μL噴霧或飼喂處理昆蟲，每隔10-15h處理一次，共處理3-7天至蟲體出現慢性中毒癥狀直至瀕臨死亡為止，再用2-8μL濃度為1.2-1.5%的鹽酸溶液噴霧或浸漬昆蟲2-5min，使其充分浸潤，最后365-430nm波長下置于熒光顯微鏡下觀察，熒光區域即為喜樹堿的沉積部位，解剖分離喜樹堿沉積部位，然后將該部位的大量細胞迅速置于-70℃冰箱中冷凍30-50min，將冷凍后的細胞研磨粉碎，再超聲處理7-15min，使其充分釋出蛋白質等細胞液，再將細胞液9000-12000rpm、2-9℃離心11-19min，過濾棄沉淀，保留上清液，備用；

3）將處理后的上清液，通過親和層析法過喜樹堿柱子，乙腈－水溶劑系統梯度洗脫2-5次，即可精準定位出喜樹堿與蟲體細胞相結合的靶蛋白。

2.?如權利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于所述的喜樹堿原藥含量為0.3-1.2%，優選0.5-1.0%，更優選0.7-0.9%。

3.?如權利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于所述氫氧化鈉的含量為4-8%，優選5-6%。

4.?如權利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于水含量為90-95%。

5.?如權利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于步驟1）中：喜樹堿水劑配制溫度為50-60℃，優選55-58℃。

6.?如權利要求1所述的一種喜樹堿作用于蟲體細胞靶蛋白的精準定位方法，其特征在于步驟2）中：喜樹堿溶液稀釋倍數為950-1150倍，優選1000-1100倍；細胞冷凍時間為35-45h，優選38-42h；離心轉速優選10000-11000rpm，離心溫度優選3-7℃，離心時間優選12-17min，波長為380-400nm。