[發(fā)明專利]一種基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410161277.2
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN103952497B
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊麗;唐卓
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院成都生物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6848;C12R1/93
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本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種利用DNAzyme探針來進行定性和定量檢測乙肝病毒DNA的方法。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的局限性，以PCR擴增為基礎(chǔ)檢測平臺，通過引入3’?氨基修飾的DNAzyme探針，實現(xiàn)了乙肝病毒的一步法定性及定量檢測。該技術(shù)具有靈敏度高，特異性強，檢測線性范圍廣，成本低廉，準確度高，方便操作等優(yōu)點，為乙肝病毒提供了簡單快速、準確高效、經(jīng)濟實用的檢測方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于DNAzyme探針的乙肝病毒DNA定性及定量檢測的方法。

背景技術(shù)

目前應(yīng)用最為廣泛的乙肝病毒DNA檢測方法是實時熒光定量PCR方法，熒光定量PCR有很多優(yōu)勢，包括靈敏度高、特異性強，但是該技術(shù)需要依賴昂貴的熒光定量PCR儀和熒光探針，檢測成本遠遠高于普通PCR，不利于大范圍推廣。因此，開發(fā)一種簡單快速、準確高效、經(jīng)濟實用的乙肝病毒檢測方法具有重要的社會意義和科研價值。

脫氧核酶(DNAzyme)是通過體外篩選技術(shù)獲得的具有催化功能的單鏈DNA序列，迄今通過體外篩選已經(jīng)獲得多種具有不同催化功能的脫氧核酶，包括能夠催化RNA剪切和鏈接、DNA的剪切和連接、DNA的磷酸化、卟啉的金屬化、碳-碳鍵形成以及氧化等反應(yīng)。DNAzyme除了具有多功能性，相對于蛋白酶和核酶，還具有合成簡單、成本低、易保存、穩(wěn)定性高等優(yōu)勢。目前，DNAzyme已在生物分析、醫(yī)學(xué)診斷、納米技術(shù)以及基因治療等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注并取得一系列先進的研究成果。因此，基于DNAzyme的獨特優(yōu)勢進行乙肝病毒檢測方法的開發(fā)將有望突破現(xiàn)有技術(shù)的一些障礙，為乙肝病毒的檢測提供更為經(jīng)濟實用的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡單快速、準確高效、經(jīng)濟實用的定性和定量檢測乙肝病毒的方法。

本發(fā)明具體涉及一種在PCR檢測平臺上利用DNAzyme探針對乙型肝炎病毒進行檢測的方法。方法以乙肝病毒的基因保守區(qū)域為待檢測的目標核酸序列進行PCR引物及特異性DNAzyme探針的設(shè)計。本發(fā)明所涉及的DNAzyme探針為一發(fā)夾探針，在常溫條件、未檢測到乙肝病毒時呈封閉的發(fā)夾狀態(tài)，不顯示DNAzyme活性，從而無檢測信號產(chǎn)生；當(dāng)用正反向引物對乙肝病毒S區(qū)保守序列即目標核酸序列進行擴增時，DNAzyme探針在PCR循環(huán)過程中可與目標核酸序列互補，并在引物延伸過程中由于核酸聚合酶5’-3’外切酶活性而被部分消化從而釋放出DNAzyme探針中的活性DNAzyme序列。此時，被釋放的活性DNAzyme序列便能發(fā)揮其活性產(chǎn)生多種可讀的檢測信號，如肉眼可見的顏色信號及可準確定量的光吸收信號、熒光信號等，從而報告檢測結(jié)果。

本發(fā)明以乙肝病毒S區(qū)的基因保守區(qū)域設(shè)計了相應(yīng)的引物和特異性DNAzyme探針的設(shè)計：（1）正向引物HBV-F:5’-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3’；（2）反向引物HBV-R:5’-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’；（3）特異性的DNAzyme探針：5’-CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH₂-3’。

本發(fā)明具體包括兩個操作步驟：（1）PCR擴增目標核酸并釋放活性DNAzyme序列；（2）比色/熒光報告檢測結(jié)果。

與已有的相關(guān)檢測技術(shù)相比，本發(fā)明所涉及的DNAzyme探針的3'-端進行了氨基修飾，使得目標核酸的檢測可以一步完成，無需在PCR過程中再開蓋加探針和補加引物便能獲得非常好的檢測信號，不僅使得操作過程更為簡單，更重要的是避免了PCR過程中開蓋將引起的交叉污染。此外，本發(fā)明在PCR反應(yīng)中采用了UNG體系，避免擴增產(chǎn)物的污染，使得檢測結(jié)果更為真實可靠，也降低了對操作環(huán)境的要求。