[發(fā)明專利]一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410161231.0
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN103897991A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊秀芬
• 申請（專利權(quán)）人: 楊秀芬
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

1.一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，

將含有蟲草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物低溫出罐后分裝到裝有一定分離培養(yǎng)基的分裝器皿中進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)至有蟲草菌絲體長出并與所述分離培養(yǎng)基分離，其中所述分離培養(yǎng)基包含下列重量份的組分：葡萄糖8-12，豆粕1-3及無菌水800-1200；

此外，還包括以下步驟：

步驟一、蟲草菌種的篩選，將蟲草菌絲接種于蠶蛹，通過自然培育法進行培育，在經(jīng)過一定條件的溫差和光照刺激后，選取優(yōu)良蟲草菌株作為蟲草菌種，并將蟲草菌種繼續(xù)培養(yǎng)至孢子成熟；

步驟二、蟲草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲草菌種的子囊部位組織懸于裝有一定濃度生理鹽水的組織培養(yǎng)瓶頂部，進行一定條件的光照培養(yǎng)后將生理鹽水轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，得到性狀穩(wěn)定的蟲草菌株；

步驟三、發(fā)酵培養(yǎng)，將所得到的性狀穩(wěn)定的蟲草菌株逐級擴大培養(yǎng)后，接種發(fā)酵罐進行一定時間的變溫好氧發(fā)酵，得到含有蟲草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物。

2.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟三中發(fā)酵所用培養(yǎng)基包含下列重量份的組分：土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖20-30及無菌水800-1200；

所述變溫好氧發(fā)酵的發(fā)酵條件為：充氧量8.5-9.0ppm，15-17度培養(yǎng)2-3天后，繼續(xù)于18-19度培養(yǎng)1-2天，然后于19-21度培養(yǎng)3-5天。

3.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟四中所述發(fā)酵產(chǎn)物與分離培養(yǎng)基的重量比為1∶13-18，所述分裝器皿的裝量為總?cè)莘e的16-18％，分裝完成后于20-24度進行暗培養(yǎng)35-40天。

4.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟一中所述蟲草菌絲通過以下方法得到：

切取蟲草菌株子囊部位組織，將其進行外部消毒處理后，加入到裝有少量無菌0.5-1％葡萄糖培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)瓶中，于22-24度進行組織分離培養(yǎng)3-7天后，經(jīng)過分離得到蟲草菌絲。

5.如權(quán)利要求4所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟一中所述自然培育法包括以下步驟：

步驟一，將蟲草菌絲接種于蠶蛹，將接種蟲草菌絲的蠶蛹進行變溫培養(yǎng)，所述變溫培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度順次為：12-14度培養(yǎng)2-3天，14-16度培養(yǎng)1-2天，18-19度培養(yǎng)1-2天，19-21度培養(yǎng)至蠶蛹僵化且有菌絲長出蠶蛹；

步驟二、將長出菌絲的蠶蛹進行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養(yǎng)2-7天，設(shè)定濕度為60-70度，溫度變化率為1-2度／小時。

6.如權(quán)利要求5所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，所述自然培育法的步驟二中，在進行溫度刺激培養(yǎng)至菌絲呈一定的團球狀時對培養(yǎng)物進行不低于200勒克斯的光照刺激。

7.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟二中所述光照培養(yǎng)方法為26-30度光照培養(yǎng)30-40小時；所述液體培養(yǎng)方法為將所述生理鹽水接種于含有全麥汁的試管中，于17-19度培養(yǎng)2-5天。

8.如權(quán)利要求7所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，可將得到的性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進行保存，所述固體斜面采用全營養(yǎng)培養(yǎng)基制成，保存溫度為3-4度。

9.如權(quán)利要求8所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，所述性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進行保存后，在使用前需對菌株進行菌株活化，所述菌株活化的方法為：

將接種有性狀穩(wěn)定的菌株的固體斜面于16-18度放置1-2小時后，將菌株轉(zhuǎn)接至麥汁營養(yǎng)液中，于16-18度培養(yǎng)2-4天。

10.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟三中所述逐級擴大培養(yǎng)方法為：

將性狀穩(wěn)定的菌株逐級轉(zhuǎn)接營養(yǎng)液進行液體搖床培養(yǎng)，每級轉(zhuǎn)接擴培比例不大于40倍，所述營養(yǎng)液包括下列重量份的組分：土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無菌水800-1200；其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1-3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。