[發(fā)明專利]一種表達(dá)HER2基因的細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410159081.X
• 申請日: 2014-04-21
• 公開（公告）號: CN104017772A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡思怡;查昭;沈國棟;黃輝;劉兢
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥瀚科邁博生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)HER2的細(xì)胞株及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

HER2/ErbB2蛋白受體屬于表皮生長因子受體(epidermal?growth?factor?receptor，EGFR)家族，它是由c-erbB2(her2/neu)基因編碼的具有受體酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜糖蛋白，全長分子量為185kDa，在乳腺癌、胃癌與卵巢癌等惡性腫瘤中的高表達(dá)往往預(yù)示腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良，且與放化療、內(nèi)分泌治療抵抗高度相關(guān)。由于HER2表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的表面，而在成人正常組織中不表達(dá)或者僅有極低表達(dá)，使得它成為一個(gè)良好的藥物靶點(diǎn)。第一個(gè)抗HER2的人源化單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(trastuzumab，商品名Herceptin)自從1998年上市以來在乳腺癌臨床治療中展示了獨(dú)特療效，然而還存在單藥有效率低以及病人產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象，這使得開發(fā)新型HER2靶向治療藥物成為迫切需求。?

HER2靶向藥物的臨床前研究需要在多種HER2高表達(dá)移植瘤模型中評價(jià)藥物的生物學(xué)活性。然而，現(xiàn)有的HER2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞株數(shù)量有限，并且受到成瘤能力的限制，可用于建立移植瘤模型的非常?有限，因此需要人工構(gòu)建高效、穩(wěn)定表達(dá)HER2并且成瘤能力良好的腫瘤細(xì)胞株。2009年公開的專利“一種HER2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及其在藥物篩選中的應(yīng)用”(公開號CN101343633A)通過pEGFPN3/1載體向多種宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HER2全長基因，并篩選得到穩(wěn)定表達(dá)HER2的細(xì)胞系，但是仍然沒有解決如何在細(xì)胞中高效表達(dá)HER2的問題。?

動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)主要使用DHFR(二氫葉酸還原酶)和GS(谷氨酰胺合成酶)基因拷貝擴(kuò)增方法。因?yàn)榛驍U(kuò)增需要6至12個(gè)月，這種方法的蛋白表達(dá)結(jié)果不能在早期預(yù)測，是表達(dá)技術(shù)的限速步驟。近年來，國外一直在發(fā)展一次性表達(dá)技術(shù)，但是這些新技術(shù)通常需要高通量細(xì)胞克隆篩選才能得出中等水平的生產(chǎn)克隆。?

本發(fā)明將GC-rich基因高表達(dá)載體技術(shù)應(yīng)用于HER2基因的轉(zhuǎn)染，得到了高效、穩(wěn)定表達(dá)HER2并且成瘤能力良好的人乳腺癌細(xì)胞株，可用于新型HER2靶向藥物的篩選。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效、穩(wěn)定地表達(dá)HER2基因的細(xì)胞株以及所述細(xì)胞株的應(yīng)用。?

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的的：?

1、一種表達(dá)HER2的細(xì)胞株，其特征在于：?

所述細(xì)胞株是保藏號為CCTCC?NO:?C201421的細(xì)胞株。?

2、如技術(shù)方案1所述的細(xì)胞株，其特征在于：?

所述細(xì)胞株對HER2靶向抗體藥物曲妥珠單抗表現(xiàn)出抗性；和/?或?

在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出癌癥移植瘤模型。?

3、一種建立表達(dá)HER2的細(xì)胞株的方法，其特征在于：?

所述方法包括以下步驟：?

1)將HER2基因插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體；和?

2)利用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，得到表達(dá)HER2的單克隆細(xì)胞株。?

4、根據(jù)技術(shù)方案3所述的方法，其特征在于：?

所述表達(dá)載體為GC-rich表達(dá)載體。?

5、根據(jù)技術(shù)方案3或4所述的方法，其特征在于：?

所述HER2基因是全長基因或者其活性片段；更優(yōu)選的是，所述HER2基因是全長基因。?

6、根據(jù)技術(shù)方案3至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：?

所述細(xì)胞株對HER2靶向抗體藥物曲妥珠單抗表現(xiàn)出抗性；和/或?

在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出癌癥移植瘤模型。?

7、如技術(shù)方案3至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：?

所述細(xì)胞株為人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，更優(yōu)選的是，所述細(xì)胞株是保藏號為CCTCC?NO:?C201421的細(xì)胞株；和/或?

所述細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出人乳腺移植瘤模型；?

8、如技術(shù)方案1所述的細(xì)胞株或者由技術(shù)方案3至7中任一項(xiàng)?所述的方法建立的細(xì)胞株在篩選癌癥藥物中的應(yīng)用。?

9、如技術(shù)方案7所述的應(yīng)用，其特征在于：?

所述癌癥為惡性腫瘤。?

10、如技術(shù)方案8所述的應(yīng)用，其特征在于：?

所述癌癥為乳腺癌、胃癌或卵巢癌；更優(yōu)選的是，所述癌癥為乳腺癌。?

通過本發(fā)明的方法建立的細(xì)胞株可以高效、穩(wěn)定地表達(dá)HER2，并且優(yōu)選所述細(xì)胞株對已有的HER2靶向抗體藥物曲妥珠單抗表現(xiàn)出抗性，能夠在裸鼠體內(nèi)成功構(gòu)建癌癥尤其是人乳腺癌等的移植瘤模型，可用于新型的治療癌癥例如乳腺癌的藥物的篩選。?