[發明專利]一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201410158723.4
• 申請日: 2014-04-18
• 公開（公告）號: CN103995126A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 鄭世軍;徐志超;李曉齊;王永強;曹紅
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及抗原制備及ELISA試劑盒，具體地說，涉及一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒。

背景技術

雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的敗血性傳染性疾病，其排泄物是重要的傳播媒介，同時也可通過雞蛋垂直傳播，是危害養雞業最嚴重的疾病之一。

雞白痢沙門氏菌多侵害20日齡以內幼雛，引起白色下痢，病死率極高，成年雞則可帶菌而無臨床癥狀。該病既可垂直傳播，又有嚴重的水平傳播，所以造成的危害和經濟損失巨大。目前西方國家已完全消滅了雞白痢，但我國仍然爆發嚴重。常規的雞白痢檢測方法為平板凝集，通過針刺雞采血，在平板上與雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原混合，通過出現凝集現象來判斷是否感染雞白痢沙門氏菌。由于通過針刺采血對雞應激大，容易造成雞的生產性能下降，甚至肝脾破裂死亡，蛋雞尤為明顯，同時大型雞場存欄量大，工作量繁重，而一般陰性血清在足夠時間下也會產生凝集，易造成假陽性。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是建立一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA方法，在檢測雞白痢過程中減少雞的應激，提高特異性和敏感性。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒，所述試劑盒內含有雞白痢沙門氏菌抗原GroEL蛋白。

進一步地，所述試劑盒內設有：包被雞白痢沙門氏菌抗原的抗體檢測板，酶標抗體，陽性對照為雞白痢陽性血清，陰性對照為雞白痢陰性血清。

作為優選，所述酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG抗體。

進一步地，所述雞白痢沙門氏菌抗原GroEL蛋白為純化的雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL。

更進一步地，所述雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL是由原核表達載體pET-28a-GroEL表達的，原核表達載體pET-28a-GroEL是由以下方法構建而成的：

1）設計一對含有酶切位點的特異性引物：

GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA?BamHⅠ；

GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC?XhoⅠ；

2）利用上述特異性引物，以雞白痢沙門氏菌基因組為模板，擴增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性內切酶，分別對PCR擴增產物和pET-28a原核表達載體進行酶切，用T4DNA連接酶將擴增片段的酶切產物連接到pET-28a酶切產物上，構建pET-28a-GroEL載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態中，經酶切鑒定和測序鑒定，表明重組原核表達載體pET-28a-GroEL構建成功。

進一步地，所述試劑盒內設有：封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液和終止液。

封閉液為PBST配制5%脫脂奶粉；樣品稀釋液為1×PBS；洗滌液為PBST；顯色液為100mmol檸檬酸鈉溶液24.3mL，200mmol磷酸氫二鈉25.7ml，加入50mg?TMB，臨用前加入50微升30%H2O2配制；終止液為2M濃硫酸。

本發明還提供了所述試劑盒的使用方法：

將待檢血清或者蛋黃液按1:100比例經PBS稀釋后加入抗體檢測板中，每孔100μL，并同時設立好陰、陽性對照，37℃作用1小時；接著PBST洗三遍；用PBS將辣根過氧化物酶標記兔抗雞IgG抗體按1:5000稀釋，每孔100μL加入反應板中，37℃作用30分鐘；接著PBST洗三遍；按每孔加入100μL顯色液，37℃作用約15分鐘后加入2M硫酸終止液終止反應，最后通過酶標儀檢測，陰性平均值+2.58SD為臨界值，大于臨界值判為陽性，反之為陰性。

本發明還提供了一種表達雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL的載體。

進一步地，所述載體為原核表達載體，是由以下方法構建而成的：

1）設計一對含有酶切位點的特異性引物：

GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA?BamHⅠ；

GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC?XhoⅠ；