[發(fā)明專利]一種測(cè)定天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410155218.4
• 申請(qǐng)日: 2014-04-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103940651A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇婧;席北斗;魏代春;霍守亮;紀(jì)丹鳳;王驥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 宋焰琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)期測(cè)定不同季節(jié)、不同天然水體中常見(jiàn)胞內(nèi)微囊藻毒素的水樣預(yù)處理方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)，水體的富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，從而導(dǎo)致藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生。淡水藍(lán)藻中能產(chǎn)生毒素的有四十余種，其中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是出現(xiàn)頻率最高和造成危害最嚴(yán)重的藍(lán)藻毒素，嚴(yán)重危害水體的生態(tài)系統(tǒng)健康。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了80多種微囊藻毒素的同分異構(gòu)體，最常見(jiàn)的是MC-LR、MC-RR和MC-YR，其中以MC-LR的毒性最大。

藻毒素分為胞內(nèi)藻毒素和胞外藻毒素兩種，通常情況下，藻毒素都存在于藻細(xì)胞內(nèi)，但在藍(lán)藻大量繁殖的情況下，藻類代謝、衰老或者死亡會(huì)釋放出藻毒素，因此，胞內(nèi)藻毒素會(huì)成為嚴(yán)重的安全隱患。目前胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理可以利用干藻粉或者直接利用水體中的微囊藻，但天然水體中的微囊藻少，而且長(zhǎng)期測(cè)定不同季節(jié)、不同區(qū)域天然水中的微囊藻毒素需要制備干藻粉，一方面需要很大的工作量，另一方面降低了其精準(zhǔn)性。而現(xiàn)有的直接利用天然水中微囊藻的預(yù)處理需要10L或者2L水樣，一方面會(huì)導(dǎo)致需要水量過(guò)多而加大采樣負(fù)荷、延長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間，另一方面可能會(huì)導(dǎo)致微囊藻過(guò)少所取水量過(guò)小檢不出微囊藻毒素。傳統(tǒng)方法采用的細(xì)胞破碎時(shí)間以及離心次數(shù)一致，不適用于不同季節(jié)微囊藻含量變化幅度大的情況，精準(zhǔn)性不高。總之，現(xiàn)有的測(cè)定胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法不適用于不同區(qū)域的天然水體，沒(méi)有形成一個(gè)系統(tǒng)的可執(zhí)行的預(yù)處理方法。

因此為了高效的測(cè)定不同天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的含量，其預(yù)處理方法的確定和改進(jìn)是一項(xiàng)亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定天然水中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法，以解決背景技術(shù)中存在的工作量大、精準(zhǔn)性不高、適應(yīng)性不強(qiáng)等問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的測(cè)定胞內(nèi)微囊藻毒素的水樣預(yù)處理方法，其步驟為：

1）過(guò)濾水樣前鏡檢，根據(jù)水樣的渾濁程度和微囊藻的檢出效果確定需要的水量；

2）過(guò)濾水樣，將濾膜剪碎渦旋混勻后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并離心分離出上清液；

3）在活化過(guò)的固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液，并除雜；

4）洗脫富集在固相萃取萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待測(cè)。

所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟1）的水樣是用電子顯微鏡鏡檢兼目測(cè)。

所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟2）是加入5%的乙酸渦旋混勻，通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行間歇破碎10-15min至無(wú)塊狀濾膜。

所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟2）的離心重復(fù)2-4次至離心管中顏色接近原濾膜色，每次離心前先進(jìn)行渦旋混勻。

所述的預(yù)處理方法中，步驟3）的富集是用Waters?HLB固相萃取小柱，流速為3mL/min；而活化和除雜時(shí)流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。

所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟4）是用含有0.1%三氟乙酸（TFA）的90%的甲醇溶液洗脫。

本發(fā)明的技術(shù)效果是：

本發(fā)明在過(guò)濾水樣前鏡檢，根據(jù)水樣的渾濁程度和微囊藻的檢出效果確定需要的水量，節(jié)省時(shí)間，避免藻殘留，提高了過(guò)濾水樣的利用率，適用于測(cè)定不同季節(jié)不同區(qū)域的大批量水樣；將濾膜剪碎渦旋混勻后進(jìn)行細(xì)胞破碎，而且破碎時(shí)間由濾膜的破碎程度決定有助于藻細(xì)胞的徹底破碎，提高效率；進(jìn)行細(xì)胞破碎及離心之前渦旋混勻，有利于微囊藻毒素的釋放；離心的次數(shù)由離心管中濾膜的顏色決定，可以在最短的時(shí)間最有效地將沉淀與上清液分離，并將釋放出的微囊藻毒素收集起來(lái)，減少預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的誤差；在HLB固相萃取小柱中進(jìn)行活化、萃取時(shí)液體不能低于上層篩片，都有助于增加小柱的活性；富集過(guò)程的流速比活化和除雜過(guò)程的流速低，使得釋放的胞內(nèi)微囊藻毒素更好更徹底的富集在小柱內(nèi)。用含有0.1%TFA的90%甲醇溶液洗脫，能更有效地將富集在HLB小柱中的微囊藻毒素洗脫下來(lái)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的水樣預(yù)處理方法，包括如下步驟：

1）混勻水樣后利用顯微鏡鏡檢，可明顯檢測(cè)出微囊藻存在，水樣渾濁取0.5L，不渾濁取1L；可檢出微囊藻存在，水樣渾濁取1L，不渾濁取1.5L；不可檢出微囊藻存在，水樣渾濁取2L，不渾濁取3L，通過(guò)0.45um的GF/C濾膜過(guò)濾。