[發(fā)明專利]一種檸條錦雞兒轉(zhuǎn)錄因子CkMYB4及其基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410152593.3
• 申請日: 2014-04-10
• 公開（公告）號: CN104087597A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李國婧;李高;王瑞剛;楊杞;齊力旺
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種MYB類轉(zhuǎn)錄因子。具體的說明，本發(fā)明涉及到一種來源于豆科灌木植物檸條錦雞兒(Caragana?korshinskii?Kom.)的編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子的基因，命名為CkMYB4。本發(fā)明還涉及該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，以及含有這類基因的載體，以及利用這類基因在木質(zhì)素基因工程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

木質(zhì)素是維管植物中廣泛存在芳香族多聚物，主要由羥基肉桂醇衍生而來，廣泛分布于維管植物中。維管植物生物量的20％-30％是木質(zhì)素，是含量僅次于纖維素的第二大類有機物質(zhì)，也是最大的一類次生代謝物質(zhì)。木質(zhì)素主要存在于植物的次生壁中，它與纖維素、半纖維素共價結(jié)合在一起，增加了細胞壁的強度和剛性，使得植物能夠直立生長；木質(zhì)素的疏水性有利于水分的運輸，增強輸導(dǎo)組織強度；此外，木質(zhì)素能夠幫助植物抵抗病原菌和微生物、抵抗機械損傷、抵抗紫外輻射等。

木質(zhì)素的合成及調(diào)控成為植物基因工程研究的熱點，主要是因為以下原因：過高的木質(zhì)素影響造紙工業(yè)中的出漿率，化學(xué)的方法除去木質(zhì)素又會造成成本增加和環(huán)境污染；飼草中木質(zhì)素含量過高影響牲畜的消化和營養(yǎng)吸收，甚至導(dǎo)致疾病發(fā)生；生物燃料乙醇生產(chǎn)過程也會因為木質(zhì)素而導(dǎo)致發(fā)酵效率降低。因此，使植物的木質(zhì)素含量減少或變得更容易去除是木質(zhì)素基因工程的目的。近些年來發(fā)現(xiàn)很多木質(zhì)素合成調(diào)控有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，例如負調(diào)控木質(zhì)素合成的AtMYB4，正調(diào)控木質(zhì)素合成的AtMYB58和AtMYB63，以及其它植物中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，這也為木質(zhì)素調(diào)控的基因工程提供了新的研究方向。

檸條錦雞兒是一種具有極大生態(tài)價值和經(jīng)濟價值的灌木，作為豆科植物，同其它豆科飼草一樣具有很高的營養(yǎng)價值，是我國北方地區(qū)重要的飼草。極強的抗逆性又使得檸條錦雞兒具備了其它飼用植物沒有的優(yōu)良特性，可以在干旱荒漠地區(qū)進行生態(tài)造林的同時利用在飼料和工業(yè)生產(chǎn)中去，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟價值。但是檸條錦雞兒莖稈粗硬，G型木質(zhì)素比例過大，使其在工業(yè)制漿及飼用方面的價值受到了影響。

本發(fā)明從檸條錦雞兒(Caragana?korshinskii?Kom.)克隆得到MYB類轉(zhuǎn)錄因子，命名為CkMYB4。構(gòu)建植物表達載體，在模式植物擬南芥中過量表達該基因后導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物木質(zhì)素合成酶基因表達量上調(diào)、木質(zhì)素含量升高，說明該轉(zhuǎn)錄因子可以對植物木質(zhì)素的合成進行調(diào)控。該基因可能被利用于植物木質(zhì)素合成基因工程中，對植物木質(zhì)素合成進行調(diào)控。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一個可以對植物木質(zhì)素合成進行調(diào)控的CkMYB4，該基因來源于檸條錦雞兒(Caragana?korshinskii?Kom.)，其核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

本發(fā)明所提供的CkMYB4來源于檸條錦雞兒，是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個，具有SEQID?NO：2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ?ID?NO：2氨基酸序列經(jīng)過一個或者幾個氨基酸的取代、缺失或者添加且具有與序列表中的蛋白質(zhì)相同活性的由序列衍生的蛋白質(zhì)序列，表中氨基酸殘基序列是由266個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約29.87KD，等電點8.31，基因全長1106bp，擁有SEQ?ID?NO：1所示的全長cDNA序列，包括完整讀碼框801bp和111bp的3′及194bp的5′UTR區(qū)。

本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸在植物木質(zhì)素合成基因工程中的應(yīng)用，其中所述多核苷酸的序列如SEQ?ID?No：1所示。其中，植物優(yōu)選為擬南芥。

附圖說明

圖1：CkMYB4-OE轉(zhuǎn)基因植物RT-PCR檢測

圖2：CkMYB4-OE轉(zhuǎn)基因植物T2代株系基因相對表達量

圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥中木質(zhì)素合成酶基因表達檢測

圖4：轉(zhuǎn)基因擬南芥中木質(zhì)素含量檢測

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的實驗步驟進行詳細說明：

實施例1.檸條錦雞兒CkMYB4基因的克隆

取檸條錦雞兒一個月苗齡小苗用于實驗，剪取檸條苗的葉片置于1.5mL離心管中，液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。利用TRIzole法(Invitrogen)提取樣品總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(具體操作見Kit?DRR019A,TaKaRa，寶生物工程大連有限公司)。取上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物以以下引物進行巢式PCR。

MYB4-1ATGGGMMGGTCHCCKTGY

MYB4-2GTGTTCCARTARTTCTTWATYTCRTTR