[發明專利]一種鑒定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法

有效

• 申請號: 201410152098.2
• 申請日: 2014-04-15
• 公開（公告）號: CN103937890A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 姚姝;陳濤;王才林;劉燕清;張亞東;朱鎮;趙慶勇;周麗慧;趙凌;于新;趙春芳
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種鑒定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法，其特征在于：

利用PCR反應體系I中，

抗病等位基因Pi-ta特異性引物：

正向Pi-ta-F序列：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3'

反向Pi-ta-R序列：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'

抗病等位基因Pi-b特異性引物：

正向Pi-b-F序列：5'-GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3'

反向Pi-b-R序列：5'-TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3'

和PCR反應體系Ⅱ中，

感病等位基因pi-ta特異性引物：

正向pi-ta-F序列：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3'

反向pi-ta-R序列：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'

感病等位基因pi-b特異性引物：

正向pi-b-F序列：5'-TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3'

反向pi-b-R序列：5'-TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3'

同時擴增水稻品種的基因組DNA，如果體系I所用兩對引物能同時擴增出1,042?bp和365?bp兩條特征條帶，即為含Pi-ta和Pi-b基因的純合體；如果體系Ⅱ所用兩對引物能同時擴增出1,042?bp和803?bp兩條特征條帶，即為含pi-ta與pi-b基因的純合體；如果體系I和體系Ⅱ分別擴增出1,042?bp和803?bp的特征條帶，則為含Pi-ta與pi-b基因的純合個體；如果體系I和體系Ⅱ分別擴增出365?bp和1,042?bp，則為含pi-ta與Pi-b基因的純合個體。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

（1）水稻植株基因組DNA的提取；

（2）將權利要求1所述的稻瘟病抗病等位基因Pi-ta特異性引物與Pi-b特異性引物加入PCR反應體系I中，同時將權利要求1所述的感病等位基因pi-ta特異性引物與pi-b特異性引物加入PCR反應體系Ⅱ中，并對水稻種質資源或育種群體植株的DNA進行擴增；

（3）PCR反應體系I和Ⅱ中20?μL?PCR反應體系包括：10?ng/μL的?DNA?2.0?μL，含25?mmol/L?MgCl₂的10×PCR?Buffer?2.0?μL，2.5?mmol/L的dNTP?0.4?μL，5?U/μL?的Taq0.5?μL，ddH₂O?13.1?μL和4?pmol/?μL的引物2.0?μL?：其中體系I中為引物Pi-ta-F、Pi-ta-R、Pi-b-F和Pi-b-R各0.5?μL，體系Ⅱ中為引物pi-ta-F、pi-ta-R、pi-b-F和pi-b-R各0.5?μL；?

（4）PCR反應體系I和Ⅱ中的程序包括：95℃預變性3?min；然后94℃變性1?min，55℃復性?1?min，72℃延伸1?min，6個循環；再進行94℃變性1?min，55℃復性50?s，72℃延伸30?s，32個循環，最后72℃延伸6?min，10℃冷卻10?min后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應；

（5）反應產物在質量比濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠染色并于凝膠成像。