[發明專利]一種百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡及制備方法

有效

• 申請號: 201410151332.X
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN104122389A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 張玉寶;王亞軍;郭志鴻;謝忠奎;王若愚;何玉惠
• 申請（專利權）人: 中國科學院寒區旱區環境與工程研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及一種檢測試劑卡及制備方法，具體的是一種用膠體金免疫層析法快速檢測百合斑駁病毒(LMoV)的試劑卡及其制備方法。

背景技術

百合(Lilium?spp)是一種集觀賞、食用、藥用價值于一身的重要經濟作物。2005年，觀賞百合主要生產國荷蘭的面積達到3800hm²，占全球總面積的72％，每年生產22.1億個百合種球，其中約1.0億個出口到中國。甘肅省蘭州市及其周邊定西、臨夏等地區食用百合的面積已近10000hm²，直接參與百合種植的農戶已超過9萬戶，百合已成為產區農戶的主要收人來源。盡管上世紀80年代末我國就開始了百合切花生產，但由于百合種球繁育技術以及病毒檢測等技術的落后，導致自繁種球質量差、增重慢、感病嚴重，生產中使用的種球90％以上依賴進口，耗資巨大。更重要的是進口種球價格高，病毒病卻沒有保障，導致我國百合切花生產成本居高不下而切花質量卻參差不齊，嚴重影響了百合產業的健康、高效發展。食用百合種植一茬需要3～5年的時間，主產區受土地面積的限制，重茬嚴重。連茬引發的病害尤其病毒病嚴重影響了食用百合的生長，使百合產量降低，品質下降，經濟效益減少。

目前文獻報道侵染百合的病毒有20多種，其中百合斑駁病毒(Lily?mottle?virus，LMoV)和百合隱癥病毒(Lily?symptomless?virus，LSV)是發生最普遍、危害最嚴重的兩種病毒，其他病毒均為局部地區發生。LMoV可在世界范圍內廣泛分布，特別是在適合其寄主生長的所有溫帶地區及蚜蟲媒介豐富的地區尤為普遍。LMoV侵染百合科植物常造成葉片有斑駁條紋甚至壞死斑，后期發展為花、葉片卷曲畸形，開碎色花，并常伴隨植株矮小、花與球莖的減產等。百合斑駁病毒屬于馬鈴薯Y病毒科、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。病毒粒子為彎曲線狀且呈螺旋對稱，大小(650～900)nm×(11～15)nm。病毒基因組為單分子正鏈RNA，約9.4kb，具有potyvirus屬成員的典型基因組結構特征，包括一個Poly(A)尾巴，編碼一個由3095個氨基酸組成的分子量為351.0kDa的多聚蛋白。多聚蛋白通過自我剪切后形成外殼蛋白(CP)等10個不同大小的功能蛋白。LMoV?CP亞基由274aa組成，大小為30kDa左右，組裝成外殼包裹病毒RNA。

目前與百合病毒相關的研究主要集中在病毒脫除和病毒檢測上，病毒檢測研究雖然有電子顯微鏡技術、酶聯免疫法(ELISA)以及分子生物學技術(RT-PCR和基因芯片技術)等的相關報道，但都還停留在研究和實驗室階段，無法滿足百合種植現場及田間快速檢測的需求，從而無法掌握百合病毒感染的準確信息。此外，包括ELISA和RT-PCR等方法在內的傳統實驗室檢測方法都存在程序復雜，檢測費用高、對儀器設備和檢測條件要求高，需要長期經驗積累和具有專業操作技能的人員才能完成等實際問題，因此使用范圍受到很大的局限性。

膠體金免疫層析是以硝酸纖維素膜為載體，通過液體的滲移，利用抗原抗體的結合，以及膠體金呈現顏色反應來檢測抗原或抗體。該方法可以避免以上幾種檢測方法的缺點，以其特異性強、成本低、操作簡便、不需任何儀器、適合現場快速檢測等優點已被廣泛接受，已用于多種植物病毒的檢測等，包括馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草斑駁病毒、南瓜花葉病毒等。作為一種快速篩查的手段，既可節省檢測成本，又可用于廣大基層單位開展百合病毒的檢測和防控工作中，具有重要的經濟價值和社會價值。但是至今國內外還沒有用膠體金免疫層析法檢測LMoV的相關報道，更無商品化的LMoV膠體金免疫層析檢測試劑卡，很難滿足國內觀賞及食用百合的病毒檢測需求。因此建立科學、快速、靈敏、穩定、易操作的LMoV檢測方法及試劑卡，是生產百合脫毒株的基礎，是提高百合產量和品質的前提。

發明內容

本發明的目的是提供一種用膠體金免疫層析法快速檢測LMoV的試劑卡及其制備方法。本發明試劑卡檢測快速，檢測準確率高，特異性強，攜帶方便，操作簡便，檢測重復性好，無需任何儀器和設備。

本發明的技術方案為：