[發明專利]檢測體細胞核移植胚胎發育能力的引物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201410150697.0
• 申請日: 2014-04-15
• 公開（公告）號: CN104031985A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 何洪彬;郇延軍
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術領域

本發明涉及檢測體細胞核移植胚胎發育能力（Thy1基因的甲基化程度）的引物、試劑盒及方法，屬于早期胚胎發育領域。

背景技術

近些年來，體細胞核移植技術得到迅猛發展和廣泛應用，使良種動物的生產從基礎研究邁進產業化，而產業化成功的關鍵就在于體細胞核移植胚胎的發育。目前，體細胞核移植胚胎發育水平比較低，制約著體細胞核移植胚胎的產業化發展，研究表明，這主要與體細胞核移植胚胎的重編程程度相關，其中組織特異性基因的持續表達是核移植胚胎發育失敗的重要原因，而目前對核移植胚胎中組織特異性基因的甲基化沒有相關報道，因此，明確組織特異性基因在體細胞核移植胚胎中甲基化模式，進而指導克隆胚胎的產業化是十分重要的。

現已證明，體細胞核移植胚胎重編程不完全導致組織特異性基因持續表達，其中Thy1基因是成纖維細胞的標記基因，在核移植胚胎中的沉默程度決定了胚胎的發育能力，因此檢測Thy1基因在核移植胚胎中的甲基化程度可預測克隆胚胎的發育潛能。目前，對于基因甲基化區域的測定通常是采用預測法，直接將預測的區域作為該基因甲基化區域。然而研究表明，采用預測法獲得的甲基化區域并不一定能代表該基因的甲基化水平，而且對于一些基因，并不能預測到甲基化區域，這就需要對Thy1基因的整個甲基化區域進行測序，并進一步明確Thy1基因甲基化區域，Thy1基因甲基化區域的明確將在體細胞核移植胚胎的生產和科學研究領域中具有實際應用價值。

發明內容

針對上述現有技術，本發明所要解決的技術問題是明確組織特異性基因Thy1甲基化區域，檢測該區域在核移植胚胎中的甲基化程度，用以確定核移植胚胎的發育階段及發育能力。本發明還根據該甲基化區域，提供了用于檢測的引物、試劑盒及方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

檢測體細胞核移植胚胎發育能力（檢測Thy1基因甲基化程度）的引物對，如SEQ?ID?NO.6～SEQ?ID?NO.9所示；該引物對可以擴增Thy1基因的一段甲基化區域，該段的序列如SEQ?ID?NO.16所示。

上述引物對，可以用于制備檢測體細胞核移植胚胎發育能力（檢測Thy1基因甲基化程度）的試劑盒。

一種用于檢測體細胞核移植胚胎發育能力的試劑盒（擴增并檢測SEQ?ID?NO.16所示序列的試劑盒），包括SEQ?ID?NO.6～SEQ?ID?NO.9所示的引物，以及PCR擴增反應所需要的常規試劑。比如：20μL擴增體系：10×PCR?Buffer（Mg²⁺Plus）2μL，dNTP?Mixture（各2.5mM）1.6μL，上游和下游引物（SEQ?ID?NO.6～SEQ?ID?NO.9所示）各0.4μL（10μmol/L），模板5μL,Taq?HS（5U/μL）0.1μL，ddH₂O12.5μL。

上述試劑盒可以用于檢測體細胞核移植胚胎發育能力（檢測Thy1基因的甲基化程度），具體應用時，步驟如下：

1）Proteinase?K消化待測樣品；

2）待測樣品的亞硫酸氫鹽處理；

3）以步驟2）處理后的基因組DNA為模板，利用前述擴增引物對（SEQ?ID?NO.6～SEQ?ID?NO.9所示），進行熱啟動PCR擴增，得到PCR擴增產物；

4）對步驟3）獲得的PCR產物進行測序，檢測CpG位點的甲基化程度；根據CpG位點的甲基化程度評價體細胞核移植胚胎發育能力：甲基化程度為32%以下（不包括32%）時，體細胞核移植胚胎發育到囊胚的能力為32%以下；甲基化程度為32%～55%時，體細胞核移植胚胎發育到囊胚的能力為32%～55%；甲基化程度為55%以上（不包括55%）時，體細胞核移植胚胎發育到囊胚的能力為55%以上。

進一步地，檢測某一階段胚胎時，若甲基化程度為24.03～30.03%，則該胚胎發育到囊胚的概率為19.91%（接近實際比率21.37%）。更近一步地，檢測核移植后36小時胚胎的甲基化程度，若為24.03～30.03%，則該胚胎發育到囊胚的概率為19.91%。

本發明的檢測體細胞核移植胚胎發育能力的方法，可根據核移植胚胎各個發育階段的檢測結果，評價任一時期克隆胚胎發育階段和發育能力。