[發(fā)明專利]枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410150346.X
• 申請日: 2014-04-15
• 公開（公告）號: CN103952419A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王智文;王光路;石婷;陳濤;趙學(xué)明
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N1/21;C12P25/00;C12R1/125
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及到枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）及該基因編碼的氨基酸序列及應(yīng)用。

背景技術(shù)

以細(xì)菌為宿主菌的基因工程菌具有發(fā)酵周期短、原料要求簡單、成熟的基因工程技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)。在芽孢桿菌屬中，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）在內(nèi)的許多菌株具有可靠的安全性。傳統(tǒng)菌株選育發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的突變株能夠過量合成葉酸、腺苷、肌苷、鳥苷、核黃素等一系列嘌呤途徑代謝中間產(chǎn)物或該途徑的衍生代謝產(chǎn)物，目前成為選育高產(chǎn)嘌呤類代謝產(chǎn)物重要出發(fā)菌株。作為模式菌株，目前對其生理生化特性及遺傳背景已經(jīng)有了比較深入的了解，相關(guān)的分子生物學(xué)方法和基因操作技術(shù)都比較成熟，也有利于通過理性代謝工程及系統(tǒng)生物學(xué)手段來選育嘌呤類代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌種。

腺苷琥珀酸合成酶是微生物嘌呤生物合成途徑中重要的酶，在枯草芽孢桿菌中，該酶催化GTP（鳥苷三磷酸）依賴的IMP（次黃嘌呤核苷酸）和天冬氨酸轉(zhuǎn)化生成中間產(chǎn)物腺苷酸代琥珀酸(adenylosuccinate)，后者在腺苷酸代琥珀酸裂解酶的作用下，脫去延胡索酸，生成AMP（腺嘌呤核苷酸）。目前是許多核苷類代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的重要基因工程操作靶點(diǎn)，比如用于高產(chǎn)核黃素、肌苷、鳥苷、鳥嘌呤等工程菌株的遺傳改造。核黃素（分子式C₁₇H₂₀O₆N₄，IUPAC中文名：7,8-二甲基-10-（1'-D-核糖基）-異咯嗪）是人體必需的13種維生素之一，為黃素酶類的輔酶組成部分，在生物體內(nèi)主要以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在。它作為黃素蛋白的輔酶參與機(jī)體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應(yīng)，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用。核黃素生物合成來自于嘌呤途徑的代謝產(chǎn)物GTP，通過核黃素操縱子表達(dá)的一系列酶催化，最終合成核黃素。

目前，對于采用枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建核黃素合成工程菌，尚未有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）用于核黃素高產(chǎn)菌種的選育的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高枯草芽孢桿菌核黃素合成能力的枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA編碼的氨基酸序列。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA的工程菌。

本發(fā)明的第四個目的是提供包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA的工程菌的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T），其特征是所述突變基因purA（C725T）序列如SEQ?ID?No.1所示。

枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）編碼的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）的工程菌。

包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）的工程菌產(chǎn)核黃素的應(yīng)用。

本發(fā)明所構(gòu)建的包含有枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶突變基因purA（C725T）的工程菌生物安全，遺傳背景清晰、包含的突變基因purA（C725T）可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，在搖瓶發(fā)酵條件下，提高核黃素積累水平40%以上。

附圖說明

圖1為工程菌株B.subtilis?RC1和B.subtilis?RC4核黃素合成水平發(fā)酵驗(yàn)證。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但對本發(fā)明不作任何限制。

本發(fā)明所用到的原始菌株B.subtilis168來源為BGSC（Bacillus?Genetic?Stock?Center，http://www.bgsc.org/）。本發(fā)明所用到的原始質(zhì)粒pUC18購買于生工生物工程（上海）股份有限公司（http://www.sangon.com/）。