[發明專利]運用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進行毒性分析的方法

無效

• 申請號: 201410150085.1
• 申請日: 2014-04-15
• 公開（公告）號: CN103913555A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 曹侃;壯子恒;李敏;薛婷;楊蘊敏
• 申請（專利權）人: 常州紡織服裝職業技術學院
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 顧伯興

技術領域

?本發明涉及污水毒性檢測領域，尤其涉及運用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進行毒性分析的方法。

背景技術

隨著工業的發展及城鎮化水平的提高，污水的排放量不斷增加。目前，大部分城市污水和工業廢水都進入污水處理廠集中治理，污水處理廠將污水收集統一處理，處理后的尾水除了一少部分回用外，大部分尾水排入了自然界的水體中。因此污水處理廠排放的尾水對受納水體環境將是很大的挑戰。

發明內容

?本發明提供運用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進行毒性分析的方法。

本發明采用的技術方案：運用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟：?

（1）秀麗隱桿線蟲的培養：使用線蟲培養基NGM培養秀麗隱桿線蟲，以大腸桿菌OP50為食物，在15-25℃環境下培養；

（2）大腸桿菌OP50的培養：使用LB液體培養基培養，溫度控制在15-25℃；

（3）秀麗隱桿線蟲的復蘇：取1-4只1.5ml的離心管并分別加入0.5-1.5ml的OP50溶液，將離心管放入離心機中，設置r為11000-13000rpm，離心0.5-1.5min，然后取出離心管，用微量移液器吸出750μl上清溶液，棄去，剩余的濃縮的OP50用移液器混勻后轉移到NGM培養皿的中央，輕輕轉動培養皿使OP50均勻的攤在培養皿中，待菌苔風干后，取手術刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后，用手術刀割取培養基放入新的含有OP50的NGM培養基中，然后將含有需要復蘇的秀麗隱桿線蟲的培養基放入生化培養箱中，設定溫度為15-25℃，進行培養；

（4）秀麗隱桿線蟲的傳代：取已鋪有E.coli?OP50的NGM培養基，然后將手術刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻后，割取含有秀麗隱桿線蟲的培養基放入新的含有E.coli?OP50的培養基中，將新的培養基放入15-25℃生化培養箱中培養；

（5）秀麗隱桿線蟲的同步化：準備孕蟲生長板2-4塊，用無菌水沖洗孕蟲生長板，吸取2.5-4.5ml的秀麗隱桿線蟲洗脫液于50ml離心管中，取0.5ml的5M?NaOH溶液與1ml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每1-3min振蕩一次，每次1-3s以將成蟲蟲體腐蝕，取3-5個1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設置離心機的r為2000-4000rpm，離心0.5-1.5min，去上清，然后向離心管中加入0.5-1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設置離心機的r為2000-4000rpm，離心0.5-1.5min，棄上清時留0.08-0.12mL的溶液，并混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli?OP50的NGM培養基中并不加在E.coli?OP50上，在超凈工作臺中晾干，將加有蟲卵的培養皿放到15-25℃的生化培養箱中，36-60h后蟲卵發育成成蟲，可進行試驗；

（6）使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進行測試：取樣4-8個典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h的秀麗隱桿線蟲置于待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱桿線蟲的存活率、生殖率、運動行為和世代周期的對比，對待測樣品進行毒性分析。

步驟（1）中秀麗隱桿線蟲的培養包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為1mm的鉑金絲挑取處于產卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲于鋪有OP50的NGM培養基中，不能破壞瓊脂層，在15-25℃的恒溫培養箱中培養；大量傳代為用經灼燒滅菌后的手術刀片切一塊含有秀麗隱桿線蟲的培養基，轉移到鋪有OP50的NGM培養基上，秀麗隱桿線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli?OP50菌苔上生長，在15-25℃的恒溫培養箱中培養。

步驟（6）中對秀麗隱桿線蟲的存活率的研究方法是取樣4-8個典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統計線蟲致死率，具體方法為：吸取尾水樣品160-200μl于96孔板中，每種水樣做三個平行樣，再取含同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲的培養皿，用無菌水沖洗培養皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱桿線蟲液密度為800-1200條/ml，再將離心管中秀麗隱桿線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15-25μl液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個孔中15-25條線蟲，最后用封口膜將96孔板封好，放入15-25℃生化培養箱中培養，12-48h后取出統計一次存活率。