[發明專利]一種以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備方法

有效

• 申請號: 201410149245.0
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103923901A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 崔建東;李連連;邊紅杰
• 申請（專利權）人: 河北科技大學
• 主分類號: C12N11/02
• 分類號: C12N11/02
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 朱江嶺

1.一種以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備方法，其特征是包括以下步驟；

a、粗孔微球硅膠的活化：

將粗孔微球硅膠浸入20%的鹽酸中浸泡8h，然后用蒸餾水洗滌，真空干燥；

b、酶-硅膠混合液的共沉淀：

稱取步驟a中活化的粗孔微球硅膠50-150mg，緩慢加入苯丙氨酸解氨酶酶液中，緩慢攪拌10min，然后加入硫酸銨粉末，邊加入邊攪拌,使得最終硫酸銨的質量百分濃度達到40%，得到酶-硅膠混合液的共沉淀聚體懸浮液；

c、酶-硅膠混合液的共沉淀聚體的共價交聯：

向步驟b所得酶-硅膠混合液的共沉淀聚體懸浮液中加入戊二醛水溶液，令最終戊二醛的體積百分濃度為0.1-0.3%，在4-25℃條件下攪拌交聯1-3h，得到共價交聯的混合物；

d、以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的回收和保存：

將步驟c得到的共價交聯的混合物在4-25℃條件下靜置1-5min，取固體沉淀用Tris-HCl緩沖液洗滌3次，直至上清溶液中檢測不出來苯丙氨酸解氨酶活性，冷凍真空干燥，得苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體，最終將干燥后的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體保存在4℃；

所述的Tris-HCl緩沖液摩爾濃度為50mmol/L,pH值為8.8。

2.如權利要求1所述的一種以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備方法，其特征是，所述步驟a粗孔微球硅膠的活化包括以下具體步驟：

準確稱取5g粗孔微球硅膠，浸入50mL20%的鹽酸中浸泡8h，所述的粗孔微球硅膠顆粒的粒徑范圍為2-5mm；在4℃條件下，以3000r/min離心5min，棄去上清，獲得的沉淀用蒸餾水洗滌3次，干燥后得到活化的粗孔微球硅膠，所述的干燥為真空冷凍干燥。

3.如權利要求1所述的一種以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備方法，其特征是，所述步驟b酶-硅膠混合液的共沉淀包括以下具體步驟：

將苯丙氨酸解氨酶粉溶解于Tris-HCl緩沖液中制成質量百分濃度為10mg/ml的酶液，往1ml酶液中緩慢加入步驟a中所述的活化粗孔微球硅膠100mg，緩慢攪拌10min，然后往酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，邊加入邊攪拌，使得最終硫酸銨的質量百分濃度達到40%，然后在4℃條件靜置5min，使苯丙氨酸解氨酶沉淀，制備出酶-硅膠混合液的共沉淀聚體懸浮液。

4.如權利要求1所述的一種以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備方法，其特征是，所述步驟c酶-硅膠混合液的共沉淀聚體的共價交聯包括以下具體步驟：

向步驟b所得酶-硅膠混合液的共沉淀聚體懸浮液中加入戊二醛溶液，控制戊二醛溶液終濃度為體積百分比的0.2%，4℃條件下攪拌交聯3h，得到以粗孔微球硅膠為內核的酶聚體共價交聯物。

5.如權利要求1所述的一種以粗孔微球硅膠為內核的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備方法，其特征是，所述步驟d中，將步驟c得到的以粗孔微球硅膠為內核的酶聚體共價交聯物在25℃條件下靜置5min。