[發明專利]一種酰胺類化合物降解酶ACE123、編碼基因及應用

有效

• 申請號: 201410148056.1
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103981165A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 馬云;溫榮提;張豆;劉學虎
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;A62D3/02;A62D101/04;A62D101/28;A62D101/26
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種酰胺類化合物降解酶ACE123，其特征在于所述降解酶ACE123的氨基酸序列為SEQ?ID?No.1所示。

2.一種權利要求1所述酰胺類化合物降解酶ACE123的編碼基因ace123，其特征在于所述編碼基因ace123的核苷酸序列為SEQ?ID?No.2所示。

3.一種含有權利要求2所述編碼基因ace123的重組載體。

4.一種用權利要求3所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。

5.如權利要求2所述酰胺類化合物降解酶ACE123的編碼基因ace123在制備重組酰胺類化合物降解酶ACE123中的應用。

6.一種權利要求1所述酰胺類化合物降解酶ACE123在降解酰胺類化合物中的應用，其特征在于所述的應用為：

（1）將含有酰胺類化合物降解酶ACE123編碼基因的重組基因工程菌接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，32～37℃培養8h，將培養液按體積比1：50轉接到含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，培養至OD₆₀₀達到0.5，加入IPTG并使其終濃度為0.3～0.5mM，20～25℃誘導培養8～12h，誘導培養結束后將培養液離心，收集濕菌體，再將濕菌體超聲破碎，離心，取上清液利用Ni-NTA純化樹脂分離純化，收集流出液，流出液減壓濃縮去除洗脫劑，獲得酰胺類化合物降解酶ACE123；（2）以酰胺類化合物為底物，以步驟（1）制備的酰胺類化合物降解酶ACE123為催化劑，于pH值為8的磷酸緩沖液中構成轉化體系，在37℃下轉化反應2h，向反應液中加入6mol/L的鹽酸水溶液終止反應，將反應液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，獲得含有降解產物的混合液，將混合液提純，獲得降解產物。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述酰胺類化合物為對乙酰氨基酚、2-乙基-6甲基--N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺、N-(3',4'-二氯苯基)丙酰胺敵稗或3-氯氨基甲酸異丙基酯。

8.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述反應體系中，底物的初始濃度為10mg/L，催化劑用量為1mg/L。

9.如權利要求6所述的應用，其特征在于步驟（1）所述分離純化的方法為：將上清液加到Ni-NTA純化柱子，上樣流速為1mL/min，上樣結束后，依次用20倍柱床體積的結合液、咪唑終濃度為20mM的結合液、咪唑終濃度為40mM的結合液洗滌柱床，關閉流速閥，加入10倍柱床體積的咪唑濃度為300mM的結合液，攪動柱床，浸泡20min，打開流速閥，收集流出液，減壓濃縮去除洗脫劑，獲得純化后的蛋白，即為酰胺類化合物降解酶ACE123；所述結合液為25mL的4M的NaCl水溶液，4mL的1M、pH值8.0的Tris水溶液和1mL的1M的咪唑水溶液，用去離子水定容到200mL配制而成。