[發明專利]肝癌特異性GP73核心啟動子及其篩選構建方法

有效

• 申請號: 201410147647.7
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103981185A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 王毅剛;劉濤;馬步云;黃盼盼;周秀梅;劉新垣
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物技術和基因治療領域，具體地說，是涉及一種肝癌特異性的啟動子GP73啟動子的核心序列的篩選和克隆，以及攜帶GP73啟動子靶向肝癌腺病毒載體GD55的構建和應用。

背景技術

對于大多數種類的癌癥，目前仍然采用的是傳統療法如外科手術、放療、化療等，而面對很多中晚期惡性腫瘤，傳統療法顯得束手無策，主要表現在治愈率低、復發率及死亡率高、預后較差。基因治療是通過將外源正常基因導入靶細胞以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，人們對腫瘤的基因治療寄寓極高的熱情，64.2%的基因治療臨床試驗均用于腫瘤治療。到目前為止，腫瘤的基因治療研究已取得了重要進展；對于惡性腫瘤，基因治療可利用腫瘤細胞與正常細胞間分子水平的差異，顯著拓寬腫瘤的“治療窗”，能高效地、選擇性地殺傷腫瘤細胞或阻止腫瘤細胞生長以及防止腫瘤的轉移。

2001年，中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所的劉新垣院士突破性的提出了癌癥的靶向基因-病毒治療（Cancer?Targeting?Gene-Viro?Therapy）概念，綜合了基因治療和病毒治療兩者的優勢，表現出良好的協同作用，大量的體內、外研究實驗表明靶向基因-病毒治療的效果要明顯優于單獨的基因治療或者病毒治療的效果。其主要是以溶瘤腺病毒為載體，將目的基因插入到病毒基因組中，隨著病毒在腫瘤細胞中的不斷增殖，抗癌基因也隨之發生數百倍乃至千倍的復制，從而大量表達抗癌基因，克服了基因治療中，基因轉染效率低和基因拷貝數低的問題，也解決了病毒治療中殺傷力弱的問題，成為今后癌癥基因治療、病毒治療的新趨勢。

腺病毒載體具有許多獨特的優點：腺病毒相對穩定；安全性較好，在人類的腫瘤細胞中尚未發現有腺病毒的整合，未發現其與人類腫瘤的發生有直接關系；腺病毒基因組較大（36kb），插入大片段外源性基因的潛力大；腺病毒的感染不依賴細胞周期，故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞；細胞及動物實驗表明，腺病毒載體容易將外源基因直接轉移到靶細胞中，并使其在細胞內有效表達成活性蛋白；腺病毒基因組較易操作。

利用腫瘤特異性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因是構建腫瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治療基因只能在腫瘤細胞內表達，而在正常細胞中不表達，從而大大降低了腫瘤基因治療的副反應而增強了其靶向性和療效。近年研究表明，GP73同肝癌關系密切。2010年北京協和醫院的毛一雷教授用免疫沉淀法檢測，率先完成了超過4000例的大樣本的GP73的研究，GP73診斷肝癌的敏感度和特異度分別達到了75%和95%，而AFP的僅有58%及85%。2013年湯紹輝博士收集已經發表的用酶聯免疫法檢測GP73相關的文獻，整理得到樣本5279例，其中肝癌2075例，進行Meta分析，GP73診斷肝癌的敏感度和特異度分別達到了78%和84%，而AFP的僅有55%及80%。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage?colony?stimulating?factor，GM-CSF)是一種具有廣譜效應的多肽生長因子，它通過結合特定的高親和力受體起作用，在調節白細胞和造血功能中有重要作用，可以維持造血前體細胞和成熟血細胞(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核/巨噬細胞)的存活；能夠促進造血前體細胞(包括粒細胞、單核細胞和巨核細胞等前體細胞)增殖分化，GM-CSF能增強中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬功能，還能增強巨噬細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用，對粒細胞和巨噬細胞有直接的趨化作用。GM-CSF作為目前已知功能最強大的免疫調節分子，在增強機體抗腫瘤免疫功能方面顯示了良好的應用前景，并被廣泛應用于腫瘤的免疫治療。GM-CSF可通過以下機制參與免疫調節：(1)提高腫瘤細胞MHC分子的表達；(2)誘導樹突狀細胞的成熟、分化并增強抗腫瘤體液免疫；(3)上調共刺激分子CD86表達，逆轉T淋巴細胞免疫耐受；(4)促進效應性T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)在腫瘤部位浸潤，殺傷腫瘤細胞。以病毒為載體攜帶GM-CSF基因用于癌癥治療，已經有多個進入臨床試驗，例如JX-594、OncoVEX、CGTG-102等，并且顯現出非凡的治療效果。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種新型的肝癌特異性GP73啟動子及其篩選構建方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供肝癌特異性GP73核心啟動子，為以下任意一種：

p-19/-413，其序列如SEQ?ID?NO：1所示（395bp）；

p-19/-613，其序列如SEQ?ID?NO：2所示（595bp）；