[發明專利]一種利用礦物油覆蓋延長葡萄組培苗保存時間的方法

在審

• 申請號: 201410147430.6
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN104969857A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 杜國強;師校欣;徐志微
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種利用組織培養技術進行葡萄種質資源離體保存的方法。

背景技術

由于人口增長、工業污染、環境惡化等原因，一些稀有物種面臨滅絕或瀕于絕種，加上人工選擇及良種的推廣，種植品種單一化，許多有益的珍貴種質資源丟失，植物種質資源保存已成為全球性關注的課題。

離體保存種質資源是將植物外植體在無菌環境下進行組織培養保存，具有很高的繁殖系數，需要時能將保存材料大量繁殖；可克服田間保存法的缺點，不占用土地，免去田間管理；免受自然災害侵襲及病蟲、病毒危害；易于控制及便于種質交流；已成為植物種質資源保存的重要方法，受到國際植物界的高度重視。

在組織培養保存種質的過程中，由于培養基水分蒸發，營養消耗，每隔一段時間，要將培養物及時轉移接種到新培養基中，進行繼代培養。葡萄組培苗一般2個月繼代一次，最長可保存4個月左右，頻繁繼代要消耗大量的人力、物力和時間，隨繼代次數的增加，還會導致體細胞無性系變異幾率增加，有可能使保存的原始種質丟失。通過改變培養物生長條件，調控組培苗的生長節奏，延緩其生長，可以有效減少繼代次數，改良種質資源離體保存方法。

延緩組培苗生長的主要途徑有：在培養基中添加生長延緩劑；提高培養基滲透壓；降低培養溫度，改變光照強度；降低培養環境的氧氣含量等。蘋果等木本植物組培苗放入冷藏箱，降低培養溫度后延緩生長的效果很好，但葡萄抗寒性較差，大部分品種不能長期適應10℃以下冷藏箱的條件。通過在培養基中添加PP333等生長延緩劑或加入甘露醇提高培養基滲透壓可有效抑制葡萄組培苗生長，但由于室溫下培養，封口材料透氣，培養基水分蒸發殆盡，葡萄組培苗只能延長約3個月的保存時間。本發明利用礦物油覆蓋葡萄組培苗，有效抑制了培養基水分蒸發，通過降低培養環境的氧氣含量，延緩了組培苗生長，延長了保存時間。

發明內容

本發明建立了一種延長葡萄組培苗保存時間的方法，為有效利用組織培養技術進行葡萄種質資源的離體保存提供技術支撐。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：將葡萄組培苗嫩梢去掉葉片，切分成單芽莖段接種，在培養基表面倒入無菌礦物油覆蓋組培苗，常規培養條件培養，可有效延長葡萄組培苗的保存時間。

本發明的具體內容，即延長葡萄組培苗保存時間的具體方法步驟如下：

（1）制備葡萄繼代培養基：B5+IAA0.5mg/L+蔗糖25.0g/L+瓊脂6.0g/L，培養基滅菌前調節pH6.0；培養容器采用50ml或100ml三角瓶，若考慮節省礦物油，可選用50ml三角瓶。

（2）將葡萄組培苗嫩梢去掉葉片，切分成1.5cm左右的單芽莖段，接入培養基中；在培養基表面倒入無菌礦物油，礦物油液面高出培養基表面5-6cm，50ml三角瓶約需40ml，100ml三角瓶約需80ml，用封口膜封口。

（3）常規培養條件：溫度25±3℃，光照強度2000lx左右，光照時間10-14h/d。

（4）覆蓋礦物油的葡萄組培苗一般可保存15個月以上。

（5）去掉礦物油后，無需沖洗，保存的組培苗即可恢復生長。

本發明專利的有益效果是，通過礦物油覆蓋，顯著減少了培養基水分蒸發，降低了培養環境的氧氣含量，有效延緩了葡萄組培苗生長和營養消耗，成功將葡萄組培苗的保存時間由4個月延長至15個月以上，大大減少了繼代接種的工作量，也降低了變異幾率。該技術可應用于巨玫瑰、莫麗莎、巨峰、夏黑、粒粒特、皇家夏天、皇家秋天、克瑞森、赤霞珠、紅斯威特等葡萄品種組培苗，具有適應品種廣、保存時間長、成本低（礦物油可重復利用）、操作簡便、易恢復生長等優點，是目前葡萄種質離體保存的好方法。

附圖說明

圖1接種后覆蓋礦物油的葡萄組培苗。

圖2保存了15個月的葡萄組培苗。

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具體實施方式

通過礦物油覆蓋，減少了培養基水分蒸發，降低了培養環境的氧氣含量，有效延緩了葡萄組培苗生長，成功延長了葡萄組培苗的保存時間。經試驗驗證，具體實施過程要注意以下問題：（1）葡萄組培苗接種時最好去掉嫩梢葉片，只留約1.5cm長的單芽莖段，腋芽在礦物油中萌發緩慢，節間縮短，葉片明顯減小，生根晚，根細且短小，無側根，延緩生長效果好。（2）接種后要立即覆蓋無菌礦物油，如果接種后先培養一段時間，待腋芽萌發生長后再覆蓋礦物油，容易造成組培苗很快枯尖、死亡，保存時間短。（3）覆蓋礦物油最好一次加夠量，如果只高出培養基表面2-3cm，組培苗5-6個月后即長出礦物油液面，開始恢復生長，繼續存活3-4個月即干枯死亡。因此礦物油應盡量多加，一般高出培養基表面5-6cm，將到三角瓶瓶頸即可，50ml三角瓶約需40ml，100ml三角瓶約需80ml，用封口膜封口。如果開始礦物油加量不夠，待組培苗快長出液面時可以添加，只是既麻煩、又增加帶菌污染的幾率。在常規培養條件下，礦物油覆蓋法已成功保存了巨玫瑰、莫麗莎、巨峰、夏黑、粒粒特、皇家夏天、皇家秋天、克瑞森、赤霞珠、紅斯威特等十幾個葡萄組培種質及部分花卉組培苗達15個月以上。