[發明專利]檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法

有效

• 申請號: 201410147371.2
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103995119A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 李龍;章葉恩;曹洋洋
• 申請（專利權）人: 杭州貝爾塔生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于包括如下步驟：

1）豬瘟全病毒抗原的制備、滅活和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板；?

2）利用懸掛棉繩法，誘導動物咀嚼，采集唾液，處理后獲得唾液一抗，保存備用；

3）將唾液一抗，以PBST溶液1:1稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加100ul，22-28℃飽和濕度反應1小時，洗滌備用；

4）將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以?PBST溶液1:2000稀釋后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加100ul，22-28℃飽和濕度避光反應30分鐘，以PBST洗滌備用；

5）將TMB顯色劑?A液和B液1:1混合后，按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加50ul，避光反應15分鐘，隨后每個反應孔加入50ul?2M濃硫酸，終止反應；

6）放入酶標儀中，讀取OD650數據，判定結果。

2.?根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟1）為：以pH?9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬瘟C株全病毒純化滅活抗原至10000?TCID50/ml，以100ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以5%脫脂奶粉封閉，獲得ELISA反應的抗原基質，置于4℃備用。

3.?根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟2）為：以6股、直徑3mm、長1m的全棉繩索懸掛于豬群中間或圍欄上，底端高度與動物肩部齊平，并將繩索的懸掛端解松，待豬群撕咬30min后，回收繩索，并置于無菌的樣品收集袋中，用雙手放在樣品袋外擠出浸潤在繩索上的唾液，并收集與無菌的50ml離心管中，以3000g離心15min，取上清，獲得唾液一抗，保存備用。

4.?根據權利要求1所述的一種檢測豬唾液中豬瘟病毒特異性抗體的方法，其特征在于，所述的步驟6）為：將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的OD650數值，并根據以下公式判定結果：已知陽性樣品與已知陰性樣品的比值P/N≥2.1，而且已知陽性樣品的OD值≥0.35；在上述條件成立的情況下，如果待檢唾液樣品與已知陰性樣品的比值P/N≥2.1，而且待檢唾液樣品的OD值≥0.35，則判為陽性、即對應群體豬瘟抗體的陽性率≥80%；否則判為陰性，即對應群體豬瘟抗體的陽性率＜80%。