[發明專利]一種高效的MALDI板上的糖基化抑制劑篩選方法

有效

• 申請號: 201410147152.4
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103983684A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 張秋婷;涂宗財;肖輝;黃小琴;王輝;樊亮亮;包中宇
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N1/44
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種高效的MALDI板上的糖基化抑制劑篩選方法。尤其是應用在功能性食品、生物醫藥行業等。

背景技術

美拉德反應在食品領域里起著非常重要的作用。然而，它能夠改善食品色、香、味及功能性質，但是也會帶來一些不利影響，如降低食品的消化性和營養性；也會產生具有危害作用的物質（丙烯酰胺、AGEs等）導致衰老、糖尿病、癌癥等。因此，對美拉德反應的抑制劑的研究越來越引起重視。尤其是對新型的天然的具有美拉德反應抑制效果的物質的篩選更為關注。因而，急需一種高效、快速、簡單、可信的美拉德反應抑制劑的篩選方法。目前，現有的有效的糖基化抑制劑篩選方法主要有免疫分析法（ELISA）和熒光光譜分析法等。但是這些方法低效、耗時、耗能、費用高。

發明內容

為了克服現有的分析方法的耗時、耗能等不足，本發明提供一種新型的篩選糖基化抑制劑的分析方法，該方法能夠給快速的篩選出是否具有糖基化抑制效果，而且能夠定量的比較不同抑制劑的抑制性。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：采用MALDI板上反應，高效篩選鑒定糖基化抑制劑。本方法選取具有任意（具有較多游離氨基的更好）多肽與還原糖（葡萄糖、半乳糖等）的一定比例的Tris-HCl混合體系為作用底物，加入不同的抑制劑后直接在MALDI板上，干熱條件下，烘箱50~65?℃，反應1~4?h，然后加入基質（α-Cyano-4-hydroxycinnamic?acid等）直接采用MALDI-TOF-MS進行檢測分析評價。通過計算DSP，評價指標可為DSP，抑制率以及IC₅₀。從而確定待測物的糖基化抑制性。

每分子肽的平均取代度(DSP)按以下公式計算：

???????????????????????????????????????????(1)?

其中I—每個糖基化肽的信號強度；i—糖基化肽中結合葡萄糖的數目。

??????????????????????????????????(2)

其中?DSP_inh?和?DSP_control?分別代表加待測物和控制組的DSP?值。

本發明的優點是，MALDI-TOF的準確度高達0.1%~0.01%，并具有高靈敏度、簡單、高效、重現性好的優點，單次可以檢測384個樣品，每個樣品所需時間僅為數秒；樣品制備時間僅需不足4h，采用質譜檢測肽的肽段糖基化程度的變化，通過計算多肽分子的平均取代度（DSP），測定肽的糖基化程度變化，進而確定待測物的糖基化抑制活性。其原理在于，美拉德反應的作用位點主要是肽鏈N端的游離氨基、賴氨酸以及精氨酸的氨基，美拉德反應的過程中會發生加糖脫水的過程，因此，肽段根據被糖基化的位點數不同，質荷比會不同的發生偏移（Δm=162,0528，324.1056…），然后通過DSP的計算進而定量表征糖基化程度在不同待測物的條件下的變化。所采用的方法具有檢測靈敏度高、速度快、能耗低，達到高效篩選糖基化抑制劑的效果。本發明所述方法簡單，耗時短，具有較高的準確性、可操作性、穩定性以及重復性。

具體實施方式

為了便于理解，下面結合具體實施例對本發明予以進一步說明。

實施例1