[發明專利]玉米胚乳特異表達啟動子50kD zein啟動子的克隆及其應用

無效

• 申請號: 201410147127.6
• 申請日: 2014-08-27
• 公開（公告）號: CN104140966A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 宋任濤;馬亞飛;張婷婷;楊曦;王冠;王珊珊;祁巍巍;梅冰;唐遠平
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/84;C12N5/10;C12N15/10;C12R1/91
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

技術領域

本發明涉及一種玉米胚乳特異表達啟動子50kD?zein啟動子及其克隆方法。

技術背景

玉米是世界上種植面積、產量、區域分布方面都占主要地位的糧食作物和飼料來源。胚乳是玉米主要的貯藏器官，因此分離和鑒定玉米胚乳特異表達的啟動子，對改造玉米籽粒性狀有重要的價值。?

啟動子是一段位于基因上游區的DNA序列，參與下游基因的表達調控，決定了基因的轉錄起始、轉錄效率和時空特異性。一般由核心啟動子和上游的一些作用元件組成，核心啟動子包括轉錄起始位點、TATA-box?以及?5’UTR?序列。上游的作用元件包括CAAT-box?、GC-box，以及一些組成型表達序列。啟動子并不直接控制基因的表達，而是通過與轉錄因子結合來控制基因的活動。

按照啟動子的作用方式和功能可以分為三大類：組成型啟動子、誘導型啟動子以及組織特異性啟動子。目前組成型啟動子在植物基因工程中應用較為廣泛，但在應用中逐漸暴露出一些問題，比如說它使外源基因在整個植株中表達，產生大量的外源蛋白質或代謝產物，打破了植株原有的代謝平衡，加重了植株的負擔，影響了植物的形態和正常的生長發育，甚至會導致植株死亡，造成資源不必要的浪費。而且轉基因安全問題一直備受關注，使用植物自身的啟動子相對而言安全性會好一些。

因此，人們正在努力尋找一些植物自身特有的組織特異啟動子，來用于轉基因載體的構建。使用組織特異啟動子，可以按照人們的意愿在生物體內表達外源基因，使外源基因更為經濟有效地發揮作用。

組織特異性啟動子(tissue-specific?promoter)又稱器官特異性啟動子。這類啟動子只在某些特定的器官或組織部位調控基因表達，并表現出發育調節的特性。其特點在于，在植物發育過程中，能夠在時間和空間上有效地調控目的基因的表達，使得目的基因的表達產物在特定的空間區域積累，按照人們的意愿改進代謝途徑，提高組織中營養物質含量，調控轉基因植物繼代繁殖,?利用種子便利地獲得工業新產品和醫藥新化合物等。因此，組織特異性啟動子，已成為轉基因研究中最具有發展前景的外源基因的啟動元件。

目前組織特異性啟動子的應用主要在以下幾方面：①改良農作物品質,?提高作物的抗凍、抗旱、抗鹽能力,?防止水果腐爛；②改良花卉品質、控制觀賞花卉的顏色；③提高植物的抗病性、抗蟲性和抗除草劑能力；④開發生物反應器用于生物制藥；⑤創建雄性不育系和恢復系；⑥用于植物的分化發育研究等。

種子是主要的營養貯藏器官，具有重要的經濟價值。因此，胚乳特異性啟動子作為一種重要的順式作用元件，具有重要的實踐意義和應用價值，今后在利用轉基因技術來提高種子中蛋白質含量和制備植物生物反應器等方面，將會有更加廣泛的應用。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種玉米胚乳中特異表達啟動子50kD?zein啟動子。

本發明的目的之二在于提供該啟動子的克隆方法。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種玉米胚乳特異表達啟動子50kD?zein啟動子，其特征在于該啟動子為下列之一：

i）?SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；

ii）SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。

一種載體，其特征在于該載體含有上述的啟動子。

一種轉基因細胞系，其特征在于該轉基因細胞系含有上述啟動子。

一種克隆上述的玉米胚乳特異表達啟動子50kD?zein啟動子的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：在NCBI數據庫中找到玉米胚乳特異表達基因50kD?zein的ATG上游序列，截取2018bp的堿基序列，設計引物，以B73基因組為模板，通過PCR技術獲得片段，獲得目的片段2018bp后，通過TA克隆連接載體，所述的引物序列為：

正向引物從5′端至3′端為：CAAGAGTAACAAATCCGC；

反向引物從5′端至3′端為：GGTTTTTGGAGTTAGATAATTGATG。

?本發明首次提出一個新的能夠在玉米胚乳中特異表達啟動子50kD?zein啟動子，該啟動子適用于啟動目標基因（如GUS基因或GFP基因）在玉米胚乳中的特異性表達。由于該啟動子的特異性很強，因此為后續進一步確定胚乳特異表達的瞬時作用元件奠定了基礎，且為植物基因工程表達載體提供合適的調控元件，為實驗室其他課題的研究進行提供新的材料。

附圖說明