[發明專利]一種腫瘤抑制多肽及用途

無效

• 申請號: 201410147068.2
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103897038A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 勞興珍;張冉;李斌;鄭珩;林雅芝
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;A61K38/10;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 孫立冰

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種高效抑制血管生成多肽、其制備方法及用途。

背景技術

研究表明腫瘤組織的最大的一個特點為具有豐富的血管生成，即從宿主引發的新的毛細管內皮細胞的形成和轉移是腫瘤生長和轉移的必備條件。新生血管一方面給腫瘤提供了其惡性增長所需的營養，另一方面給腫瘤向遠處轉移提供了途徑。如果在腫瘤形成過程中能抑制其血管內皮細胞的生成和遷移，就可以阻止腫瘤的生長和轉移。因此抑制腫瘤血管生成是腫瘤治療中日漸引起重視的一類藥物，繼血管抑素（angiostatin）和內皮抑素（endostatin）這兩種已進入美國臨床試驗的藥物之后，Tumstatin是近年來發現的一種能夠抑制新生血管生成的蛋白藥物。Tumstatin是膠原alpha3(IV)的NC1結構域，由245個氨基酸組成，具有抑制腫瘤新生血管生成和抑制腫瘤的生長和轉移作用，這兩種抗腫瘤的特性與一種非RGD依賴性的ITGB3介導的機制密切相關。Tumstatin經由與內皮細胞膜上的整合素alpha?v?beta3結合而抑制FAK（focal?adhesion?kinase）的磷酸化而進一步抑制PI3-K/Akt/mTOR/4EBP1信號轉導通路的活化，從而抑制內皮細胞蛋白質的合成，進而抑制內皮細胞的增殖，最終抑制腫瘤新生血管生長及腫瘤的生長和轉移（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100:4766-4771）。

最近,小鼠黑色素瘤模型的藥理實驗（J?Biol?Chem.2004，279(3):2091-100）證明Tumstatin的NC1(IV)N端7個氨基酸185-191(CNYYSNS)組成的肽也具有同樣的抗腫瘤生長的特性,其在三維結構上共同的特征是YSNS序列呈beta-轉角構象，這種構象是維持其生物活性的至關重要的條件。

組織穿入是向細胞遞送藥物的嚴重限制之一，如何有效地把藥物內化至細胞內是藥物傳輸中的一個重要課題。目前為止，發現了兩種類型的細胞穿入肽（cell-penetring?peptide），一類是疏水性的，一類是陽離子型的（Adv?Drug?Deliv?Rev2005，57,529-45）。Tat是其中一種可以把核酸和蛋白質引入細胞的陽離子型肽（Nat?Med2007，12,327-78；Trends?cell?Biol1998；8,84-7）。并且在體內外的實驗中，TAT與多肽結合后確實顯示了其可將藥物內化至細胞內的輔助作用，從而增強了目的藥物的效果（Mol?Ther.2009，17(9):1509-16.）。因此，TAT序列可以作為一種載體，將抗腫瘤多肽轉運如細胞內部，最大程度的發揮抗腫瘤多肽的效果。故聯合應用細胞穿入肽和抗腫瘤多肽的研究更有意義。

發明內容

本發明將抑制血管生成的tumstatin活性片段氨基酸序列（185-191）（Tumstatin-7），在其羧基端連接具有細胞穿越性的反式激活蛋白TAT(trans-activator?protein)的第47位到第57位氨基酸殘基組成的肽段序列，構建了一種具有細胞內化作用的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT。本發明多肽序列為SEQ?ID?No：1所示的氨基酸序列。它具有不同的理化性質，等電點由融合前的5.52變為11.40，水溶性也大大增加，從而減少有機性增溶溶媒的使用，而避免在臨床使用中引起的不良反應。

本發明還公開了所述血管生成抑制劑的制備方法，包括：

（1）依據本發明所述具有抑制血管生成作用的多肽序列，按常規方法設計得到相應的基因序列；

（2）將上述人工合成的基因與原核載體進行重組，轉化至大腸桿菌，乳糖誘導表達包含本發明所述具有抑制血管生成的多肽Tumstatin-7-TAT；表達產物以胞內可溶表達形式存在；

（3）收集破碎后的菌體上清，進行金屬螯合親和層析，腸激酶酶切，收集穿過液，凍干。

本發明所述的血管生成抑制劑還也可用多肽合成方法制備。

體內及體外活性藥效試驗顯示，本發明的多肽具有抑制人臍靜脈內皮細胞的遷移和抑制人肝癌細胞的功效，還具有抑制人乳腺癌細胞增殖作用及小鼠體內抗腫瘤功效。