[發明專利]敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶基因的非人哺乳動物模型及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410146792.3
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103947606A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 吳東海;聶濤;毛劉峰;李快;唐小鳳;惠曉艷;劉彭濤;徐愛民
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 曾鳳云;萬志香

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶基因的非人哺乳動物模型及其構建方法和應用。

背景技術

長期以來，一直被認為脂肪細胞的主要功能是儲存能量。但隨著對脂肪細胞的深入研究，脂肪細胞其它方面的功能也逐漸顯露出來。研究表明脂肪細胞在免疫反應、高血壓、肥胖、胰島素抵抗等代謝疾病中都起著重要的作用。

最初，脂肪細胞被分為兩類：白色脂肪細胞與褐色脂肪細胞。但隨著嚙齒動物腹股溝脂肪部位的beige(brown-in-white,brite)細胞的發現，褐色脂肪細胞又可以被細分為兩類：經典的褐色脂肪細胞與brite/beige脂肪細胞

白色脂肪細胞內含有一個巨大的圓形脂滴，細胞核呈扁平狀且位于細胞邊緣。脂滴幾乎占據了細胞的99%的空間。白色脂肪細胞主要是通過甘油三酯和膽固醇的形式，將能量儲存于脂滴當中。但是白色脂肪細胞不僅可以儲存能量，它還可以分泌脂肪細胞因子如：脂聯素、瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子α等等。這些脂肪細胞因子在能量代謝調節、免疫反應等多種生理現象中發揮著重要作用。

褐色脂肪細胞的外形呈多邊形，細胞核為圓形，且細胞內的脂滴呈多室分布于整個細胞中。褐色脂肪細胞含有大量的細胞質基質，并且細胞內的線粒體含量很高。因為線粒體內的細胞色素含有鐵原子，所以含有大量線粒體的褐色脂肪細胞的顏色為褐色。褐色脂肪細胞不同于白色脂肪細胞的主要特征是：線粒體內膜上的解偶聯蛋白1(UCP1)的表達量很高。所以，褐色脂肪細胞的主要功能就是通過UCP1來產熱從而消耗能量而不產生ATP：即褐色脂肪細胞可以通過UCP1，將線粒體內的電子傳遞鏈與ATP合成解偶聯，進而通過氧化磷酸化解偶聯呼吸，將脂肪酸β氧化產生的能量以熱量的形式散失掉。褐色脂肪細胞的非顫栗性產熱功能，可以維持體溫恒定，也可以以熱能的方式消耗機體攝入的能量，從而降低肥胖發生的概率。

兩種褐色脂肪細胞的分布是不同的，經典的褐色脂肪細胞主要分布于嚙齒動物的肩胛骨區域，而Beige脂肪細胞主要分布于腹股溝區域的皮下脂肪組織中。對于人類來說，褐色脂肪細胞主要存在于嬰兒體內，但是目前研究發現，成年人的頸部、鎖骨上也含有相當量的褐色脂肪細胞，且它們與嚙齒動物的beige脂肪細胞相似。除了分布差異外，兩種褐色脂肪細胞的來源也不同。經典的褐色脂肪細胞與肌肉細胞同源；但是beige脂肪細胞存于白色脂肪組織中。研究發現，在一定條件下，冷凍，特定基因的敲除或者視黃酸（retinoid?acid，RA），成纖維細胞生長因子21（FGF21）等藥物的刺激，beige脂肪細胞可以由白色脂肪細胞轉分化而來。因此，beige脂肪細胞的研究受到了廣泛關注。篩選可以使白色脂肪細胞褐色化(即轉分化為beige脂肪細胞)的藥物對于人類肥胖相關代謝疾病的治療具有重大意義。

篩選白色脂肪細胞褐色化的藥物，主要需要檢測UCP1的表達的變化，尤其是蛋白水平的變化。但是目前無論利用實時定量RT-PCR或者western?blot的方法進行藥物篩選，都費時費事費力費錢。實時定量PCR至少需要一天的時間來檢測UCP1的變化，而western?blot至少需要兩天的時間來進行檢測分析。

因此，構建一個可以快捷、準確地篩選白色脂肪細胞轉分化成beige脂肪細胞的藥物的平臺顯得尤為重要。

發明內容

基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶的非人哺乳動物模型及其構建方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

一種敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶的非人哺乳動物模型在篩選白色脂肪細胞褐色化的藥物中的應用。

在其中一個實施例中，所述非人哺乳動物為小鼠。

本發明還提供了一種敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶的非人哺乳動物模型的構建方法，包括以下步驟：

1)、將非人哺乳動物的解偶聯蛋白1基因的最后一個外顯子后的終止密碼子去掉；

2)、利用序列號為SEQ?ID?NO:1的串聯肽2A在步驟1)的去掉了終止密碼子的解偶聯蛋白1基因的最后一個外顯子后連入熒光素酶基因；

3)、利用C57和129雜合背景的小鼠ES細胞打靶，通過同源重組構建敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶的非人哺乳動物模型。

本發明還提供了采用上述構建方法構建得到的敲入有解偶聯蛋白1-熒光素酶的非人哺乳動物模型。