[發明專利]一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒及其研究方法

有效

• 申請號: 201410146681.2
• 申請日: 2014-04-13
• 公開（公告）號: CN103937869A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 李海山;韓輝;艾文超;李蕾;陳會明
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/26;G01N30/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種高通量篩選CYP450酶抑制藥物的試劑盒，其組成為：NADPH再生系統；0.1mol/L磷酸鹽緩沖液；混合探針底物；混合探針底物的代謝產物；肝微粒體；所述六種混合探針底物為：非那西丁（5mmol/L），咪達唑侖（250μmol/L），甲苯磺丁脲（12mmol/L），右美沙芬（500μmol/L），安非他酮（2.5mmol/L），美芬妥英（5mmol/L）；所述六種混合探針底物的代謝產物：撲熱息痛（1μg/ml），1-羥基咪達唑侖（1μg/ml），4-羥基甲苯磺丁脲（1μg/ml），右啡烷（1μg/ml），羥基安非他酮（1μg/ml），4-羥基美芬妥英（1μg/ml）。

2.按權利要求1的試劑盒，其特征在于：NADPH再生系統包括A液：2.5mmol/L?NADPNa2，10U/mL6-磷酸葡萄糖脫氫酶，20mmol/L氯化鎂，B液：50mmol/L6-磷酸葡萄糖。

3.按權利要求1的試劑盒，其特征在于：0.1mol/L磷酸緩沖液組成是29g磷酸氫二鈉，2.96g磷酸二氫鈉，42.5g氯化鈉，11.8g氯化鉀，最終溶解于1升蒸餾水中。

4.按權利要求1的試劑盒，其特征在于：肝微粒體可以是小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體中的一種，其濃度為20mg/ml。

5.一種CYP450酶抑制藥物的研究方法，其特征在于包括如下步驟：

1）通過配制245μL孵育的NADPH再生反應體系包括50μLA液+10μLB液+2.5μL混合探針底物+2.5μL系列藥物濃度+180μL0.1mol/L磷酸緩沖液預孵育于37℃水浴中5min，再加入20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體5μL，孵育1h；所述2.5μL混合探針底物在250μL孵育系統終濃度為非那西丁（50μmol/L），咪達唑侖（2.5μmol/L），甲苯磺丁脲（120μmol/L），右美沙芬（5μmol/L），安非他酮（25μmol/L），美芬妥英（50μmol/L）；

2）然后，按體積比為甲醇:乙腈=1:1的比例配置蛋白沉淀液，用3倍體積的蛋白沉淀液沉淀蛋白，渦旋震蕩2分鐘，14000轉離心10分鐘，取上清進樣于LC-MS/MS，計算系列藥物濃度對六種酶的抑制百分率，由GraphPad?Prism?5軟件繪制抑制曲線并計算IC₅₀值。

6.按權利要求5的研究方法，其特征在于：250μL?NADPH再生反應體系中NADPNa2終濃度為0.5mmol/L，6-磷酸葡萄糖脫氫酶的終濃度為2U/mL，氯化鎂的終濃度為4mmol/L，6-磷酸葡萄糖的終濃度為10mmol/L。

7.按權利要求5的研究方法，其特征在于：系列藥物濃度在250μL孵育系統終濃度為0.05、0.15、0.5、1.5、5、15、50、100μmol/L，再加一個Control組，藥物溶解的有機相用乙腈溶解，最終整個孵育體系乙腈的比例控制在1%以下即可，甲醇或二甲基亞砜溶解有機相比例應控制在1‰以下。

8.按權利要求5的研究方法，其特征在于：小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒體在250μL孵育系統中蛋白終濃度為0.4mg/ml。