[發明專利]一種基于NDV血凝素蛋白單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測試紙條

有效

• 申請號: 201410145689.7
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103937751A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 楊少華;許傳田;胡北俠;張琳;黃慶華;伊惠;張秀美
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術領域

本發明涉及獸醫生物制品領域的診斷試劑，具體提供了一種具有廣譜中和活性的單抗隆抗體和以此為抗體建立的NDV膠體金免疫層析技術及試紙條。?

背景技術

新城疫是由新城疫病毒引起的高度接觸性、傳染性疫病，可導致禽類的大量死亡或生產性能的急劇下降，給世界養禽業造成巨大的經濟損失。國內外學者對新城疫的診斷方法進行了大量研究，傳統的診斷方法包括病毒分離，ELISA、瓊脂擴散實驗、中和試驗、血凝和血凝抑制試驗等。近年來RT-PCR、熒光定量PCR、核酸診斷技術、限制性內切酶分析等分子生物學技術也廣泛應用到ND的診斷上，但上述方法繁瑣費時，需要一定的實驗條件和實驗人員及特殊的儀器設備，不方便在基層養殖場推廣使用。?

對于本領域而言，能夠快速、準確診斷該病，對疫情監測，控制流行，減少養殖成本具有重要意義。而利用具有廣譜中和作用的單克隆抗體來滿足上述要求，在現有技術的基礎上已經成為了可能，如何利用這一技術則成為現有技術亟待解決的問題。?

發明內容

本發明針對現有新城疫病毒非診斷檢測方法中存在的問題，利用新制備的抗新城疫血凝素蛋白的雜交瘤細胞株，獲得了對NDV具有廣譜中和作用的單克隆抗體，并利用該抗體研制了快速檢測新城疫病毒的免疫膠體金檢測試紙條。采用本發明的試紙只需一步加樣，5m?in就能判定結果，具有簡單快速、特異敏感的特點，本試紙條的研制為新城疫的快速診斷提供了一種更加實用的工具和方法，適合基層獸醫站和中小養殖場使用。?

本發明的具體技術方案是：?

發明人首先提供了一株全新的單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株C3B3，同時進行了生物保藏，其保藏編號為：CCTCC?NO：C2013174。?

利用該雜交瘤細胞株，發明人進一步獲得了對NDV具有廣譜中和作用的單克隆抗體，具體步驟如下：?

1.單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備?

病毒的純化：將NDV?LaSota標準病毒接種9-10日齡雞胚，收獲死亡雞胚的尿囊液，將尿囊液凍融1次，15000rpm/min離心1h，收取上清再經30000rpm/min高速離心機離心2.5h，去上清，沉淀以PBS(pH7.4)懸浮，以蔗糖密度梯度離心35000rpm/min離心2min，收獲純化的NDV?LaSota病毒；?

以純化的NDV?LaSota病毒為免疫原，免疫6周齡～8周齡Balb/c小鼠6只，每次每只的免疫劑量為50ug，免疫方法為腹腔注射，一共免疫四次；每次免疫的間隔期為2周，首免用弗氏完全佐劑按體積比1:1的比例乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐劑按體積比1:1乳化蛋白；三次免疫一周后,小鼠眼眶采血測其效價,監測血清抗體效價；四免兩周后,選擇效價最高的小鼠，用不加佐劑的蛋白腹腔注射加強免疫一次，3d后取小鼠脾臟淋巴細胞與SP2/0細胞融合，置于37℃5%CO₂培養箱培養；?

5d～7d后用HT換出1/2HAT培養基，7d～10d后用HT換出全部HAT；采用間接ELISA和血凝抑制試驗(HI實驗)篩選均為陽性的克隆作為備選雜交瘤細胞株；?

其中所述的ELISA法篩選具體是：將純化后的病毒按10ug/mL包被ELISA板，將雜交瘤細胞分泌的單抗（即細胞培養物上清）與之結合，檢測孔的OD值與陰性對照的OD值的比值大于等于2為陽性；?

所述的血凝抑制實驗的具體步驟為：吸取25μL?ELISA檢測陽性孔的營養液加入96孔V型板第一個孔中，然后以25μLPBS(pH7.4)進行倍比稀釋至第11孔，第12孔為PBS對照孔，加入4HA單位的LaSota原始標準病毒25μL，室溫作用20min后加入1%雞紅細胞25μL，?15-20min后判定結果，以不凝集雞紅細胞的最高稀釋倍數為血凝抑制價；?

通過上述方法挑取ELISA陽性和有血凝抑制性的陽性克隆以有限稀釋法亞克隆3次，最后挑選ELISA檢測中OD值反應值較高的單克隆擴大培養并作為建株細胞，并對其進行生物保藏，保藏編號為：CCTCC?NO：C2013174；?

2、單抗腹水的制備?

8周齡～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射無菌液體石蠟油0.5mL/只，7d后腹腔注射處于對數生長期的陽性雜交瘤細胞50萬/只；每天觀察至小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水并離心后取上清，從而獲得陽性雜交瘤細胞C3B3制備的單抗；?

通過離心可以去除掉腹水中的脂肪和血細胞，進而可以從腹水中獲得足量的單克隆抗體用于后續的鑒定和制備。?

3、單抗特性鑒定?