[發(fā)明專利]一種豬乙型腦炎病毒純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410145610.0
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103937757B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁旭娜;吳全忠;米娜;李倬;呂茂杰;楊保收;梁武;李守軍
• 申請（專利權(quán)）人: 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12211
• 代理人: 韓敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種病毒純化方法，尤其涉及一種豬乙型腦炎病毒純化方法。

背景技術(shù)

流行性乙型腦炎是由黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）日本乙型腦炎病毒(Japanese?Encephalitis?Virus，JEV)引起的一種人獸共患的疾病。豬被認(rèn)為是本病最重要的自然增殖動物，能引起懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎；臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。豬乙型腦炎流行不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害，而且還嚴(yán)重威脅人類健康。

疫苗是預(yù)防該病的主要方法之一。目前，我國商品化的豬乙型腦炎疫苗主要是鼠腦滅活疫苗和弱毒疫苗。其中以弱毒疫苗為主，其安全性和有效性主要受病毒滴度和抗原純凈性等因素的影響。商品化疫苗如果直接以細(xì)胞繁殖的病毒液進(jìn)行成品苗的生產(chǎn)，會受到細(xì)胞破碎產(chǎn)物，培養(yǎng)基成分，細(xì)胞代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)的影響，致使疫苗免疫動物后易發(fā)生過敏反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質(zhì)量基本途徑。

中空纖維膜過濾技術(shù)屬于切向流過濾技術(shù)（Tangential?Flow?Filtration,TFF）的范疇，又稱錯流過濾（Cross-Flow?Filtration，CFF）：料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會被膜截留，從而實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級分離。

和傳統(tǒng)的平板膜包相比，中空纖維柱具有纖維管狀的開放式流道結(jié)構(gòu)，無篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無規(guī)則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護(hù)病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時有助于雜蛋白的透過和去除。

目前，對于豬乙型腦炎病毒的中空纖維澄清純化及濃縮工藝尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有豬乙型腦炎病毒疫苗均一性差、免疫效果差等技術(shù)問題，提供一種使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)實現(xiàn)的豬乙型腦炎病毒純化方法。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種豬乙型腦炎病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實現(xiàn)，過程如下：

1系統(tǒng)的組裝

無菌條件下，將微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)按照組裝要求進(jìn)行組裝。在微濾澄清純化系統(tǒng)中可安裝無菌0.45μm或0.65μm、完整無損的中空纖維微濾膜，在超濾濃縮純化系統(tǒng)中可安裝無菌100KD或300KD、完整無損的中空纖維超濾膜。

2系統(tǒng)完整性檢測

壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。

3系統(tǒng)的處理

3.1清洗及滅菌

將0.5M?NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進(jìn)料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進(jìn)行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。

3.2水洗及通量檢測

滅菌結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無菌超純水注滿系統(tǒng)的進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。

3.3PBS處理

水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M?PBS溶液注滿進(jìn)料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。

上述所述技術(shù)方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%～80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進(jìn)行系統(tǒng)滅菌。

一種豬乙型腦炎病毒純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實現(xiàn)，該方法包括以下步驟：

1）將無菌吐溫20按0.5%～10%(v/v)的比例加入豬乙型腦炎病毒液中，振蕩處理；

2）將步驟1）振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進(jìn)料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間后經(jīng)0.45或0.65μm中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；

3）以1:1(v/v)的比例將無菌的0.1M?PBS緩沖液加入進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用；

4）以1:1(v/v)的比例將無菌的0.1M?PBS緩沖液加入到步驟3）處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；

5）以1:1(v/v)的比例將無菌的0.1M?PBS緩沖液加入到步驟4）處理完畢的進(jìn)料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；