[發明專利]一種用產丁二酸重組大腸桿菌細胞制備富馬酸的方法

有效

• 申請號: 201410144056.4
• 申請日: 2014-04-10
• 公開（公告）號: CN104974971B
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 方曉江;馬江鋒;劉經偉;李澤壯;劉麗娟;王英武;陳韶輝;楊愛武
• 申請（專利權）人: 中國石化揚子石油化工有限公司;中國石油化工股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 萬婧

1.一種用產丁二酸重組大腸桿菌細胞制備富馬酸的方法，其步驟如下：

(1)利用重組大腸桿菌采用兩階段發酵生產丁二酸；

(2)丁二酸發酵結束時，采用沉降法收集菌體回收細胞，回收低活性的產丁二酸重組大腸桿菌細胞；

(3)將回收低活性的產丁二酸重組大腸桿菌細胞，轉入新鮮培養基中，通空氣或者氧氣，并維持60％的溶氧，溫度及發酵液pH值分別控制在36℃和7.5，其中，所述的步驟(3)中的新鮮的培養基為JSM-CN培養基；

所述低活性的產丁二酸重組大腸桿菌細胞是指經過厭氧發酵36h或48h后回收的細胞；

所述JSM-CN培養基是指以JSM發酵培養基為基礎，去除葡萄糖、磷酸氫二銨、氯化銨和硫酸銨；

所述重組大腸桿菌為菌株Escherichia coli AFP111。

2.根據權利要求1所述的制備富馬酸的方法，其特征在于：所述的步驟(1)具體操作為：活化重組大腸桿菌菌體，轉接入發酵培養基，添加葡萄糖至初始濃度為20-30g·L^-1，培養過程溶氧維持在40％～60％；待葡萄糖基本消耗完時改通CO₂氣體，進入厭氧發酵產酸階段，發酵過程中補加葡萄糖，且控制葡萄糖濃度在5～20g·L^-1，同時添加二氧化碳供體，調控pH值在6.8-7.0之間。

3.根據權利要求2所述的制備富馬酸的方法，其特征在于：所述的活化重組大腸桿菌菌體為從甘油凍存管中取少量菌液，在LB平板上劃線后放置于37℃下培養12h；從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養基，在37℃，200r/min條件下至菌體密度的OD₆₀₀值在0.6～0.8之間。

4.根據權利要求1所述的制備富馬酸的方法，其特征在于：所述的步驟(2)具體操作為待發酵結束時，發酵罐內停止通氣與攪拌，靜置5～10分鐘，待細胞沉降完全后，通過壓縮空氣給罐子增壓，通過壓差將發酵罐內菌體細胞上層的發酵清液移除；或者在發酵罐外面用泵將發酵罐內的上層清液抽出發酵罐即可實現菌體的收集。