[發明專利]一種利用miR-145為標志物的肝癌患者血清檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201410143209.3
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN104450874A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 邵寧生;李少華;李慧;王瑋;丁紅梅;李潔;黃皚雪;蘇雪婷;趙強
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物醫學技術領域，具體涉及一種利用循環miR-145作為肝癌血清標志物及其檢測試劑盒。?

背景技術

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，據報道，世界范圍內每年新增肝細胞癌患者達到700,000以上。中國是全球肝癌發病率最高的國家，有統計顯示，我國肝癌發病人數占全球55％，死亡人數占全球45％，列癌癥死亡的第二位，而且發病率不斷上升。肝細胞癌的早期發現、早期診斷、早期治療對肝癌患者的預后和存活時間至關重要。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是迄今人類發現的第一個具有診斷價值的腫瘤標志物，在原發性肝細胞癌(hepatocellular?carcinoma，HCC)發生發展中扮演著重要的角色。但根據臨床資料，約有30％～40％肝癌患者血清AFP陰性，而中國又是原發性肝細胞癌的高發國家，近年來報道的血清AFP陰性原發性肝細胞癌有增多趨勢。這部分肝癌患者缺乏有效的腫瘤標志物用于預后判斷與療效評價。因此，新的肝癌血清標志物，尤其是AFP陰性肝細胞癌的血清標志物的檢測具有重要的臨床意義。?

microRNA(miRNA)是一類長約22nt的非編碼小RNA分子，它們通過與靶基因3′UTR結合降解靶基因或者抑制翻譯，在多種生理過程中發揮重要作用。研究表明，microRNA與癌癥的發生發展有十分密切的關系。許多腫瘤患者血清中循環microRNA水平發生明顯特異性變化，可以用作腫瘤檢測生物標志物。肝癌的發生發展過程由多種復雜的調控通路參與，其中miRNA也參與了肝癌致病相關基因的轉錄后調控。近期越來越多的研究發現，miRNA能夠參與到肝癌發生發展各個過程之中。?

本發明證實，miR-145在AFP為陰性的肝癌患者血漿中含量明顯低于正常，這種特性能作為這種疾病的標志分子，用于臨床診斷。進一步研究證實在肝癌細胞中miRNA-145能抑制人肝癌細胞的增殖、遷移作用。?

發明內容

本發明的目的在于提供miR-145作為肝癌血清分子標志物。?

本發明的目的在于提供一種檢測miR-145表達量的引物。?

本發明的目的還在于提供一種肝癌血清檢測試劑盒。?

本發明的目的還在于提供一種非診斷目的的肝癌血清檢測方法。?

一種檢測miR-145表達量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.2，SEQ?ID?No.3所示。?

一種肝癌血清檢測試劑盒，所述試劑盒包含序列表中SEQ?ID?No.2，SEQ?ID?No.3所示的引物，標準樣品，內參引物，反轉錄酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制劑和滅菌水。?

所述標準樣品為未經過處理的人血清樣品中的RNA反轉錄成的cDNA。?

一種非診斷目的的肝癌血清檢測方法，按照如下步驟進行：?

(1)提取待檢樣品的總RNA；?

(2)將步驟(1)得到的總RNA反轉錄為cDNA；?

(3)利用權利要求3或4所述的一種肝癌血清檢測試劑盒，以步驟(2)得到的cDNA為模板，做定量PCR，檢測樣品中miR-145的表達量；?

(4)若待檢樣品的表達量顯著高于標準樣品的表達量，則該待檢樣品取自肝癌患者的生物樣品。?

本發明的有益效果：本發明的方法簡單，迅速，靈敏，適用于檢測患者是否患有肝癌。?

附圖說明

圖1是定量PCR檢測正常人血清與AFP為陰性的肝癌患者血清中miR-145含量的結果。?

圖2是定量PCR檢測人肝癌細胞中miR-145含量的結果。?

圖3轉染NC、si-VASN、miR-145?mimics與miR-145?inhibitor后，對人肝癌細胞株HepG2中VASN?mRNA水平的影響。?

圖4轉染NC、si-VASN、miR-145?mimics與miR-145?inhibitor后，對人肝癌細胞株HepG2中VASN蛋白水平的影響。?

圖5是MTT實驗檢測轉染miR-145?mimics與miR-145?inhibitor后，對人肝癌細胞株HepG2增殖的影響。?

圖6是劃痕實驗檢測轉染miR-145?mimics與miR-145?inhibitor后，對人肝癌細胞株HepG2遷移的影響。?

圖7是Transwell實驗檢測轉染miR-145?mimics與miR-145?inhibitor后，對人肝癌細胞株HepG2遷移的影響。?