[發明專利]大豆食心蟲人工飼料及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410142210.4
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103976162A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 孟凡立;張大勇;李娜;李文濱;劉珊珊
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: A23K1/18
• 分類號: A23K1/18;A23K1/14;A23K1/16;A23K1/165;A01K67/033;A01N63/02;A01P7/04;C12Q1/68
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及大豆食心蟲人工飼料及其制備方法和應用，具體涉及制備大豆食心蟲人工飼料的方法、大豆食心蟲人工飼料、人工飼養大豆食心蟲的方法、用于篩選大豆食心蟲靶基因的方法、殺蟲劑及植物培養方法。

背景技術

大豆食心蟲目前是東北大豆產區發生最嚴重的害蟲之一，以幼蟲鉆蛀豆莢取食豆粒，將豆粒咬成溝道或殘破狀，不僅使大豆田嚴重減產，而且降低大豆品質。化學殺蟲劑是防治食心蟲的常用方法。但大量和長期使用不僅使大豆食心蟲抗藥性逐年增加，而且污染環境。轉Bt抗蟲基因一度為害蟲防治帶來希望，并在抗蟲棉的應用上取得了良好的田間防治效果和巨大的經濟效應。然而，隨著轉Bt基因棉花的大面積種植，棉鈴蟲對Bt蛋白的抗性已成為不容忽視的問題。利用傳統育種方法培育抗食心蟲大豆品種，對防治食心蟲雖然有效，但是周期長、效率低。因此，發展有效控制大豆食心蟲的新方法，是當前該領域的重要研究課題。

RNA干擾（RNA?interference）是一種由外源或內源雙鏈RNA（double-stranded?RNA，dsRNA）誘發同源mRNA特異性降解的現象，是近年來發現的一種新的基因調控機制。一般認為，雙鏈RNA在細胞內經Dicer酶切割成21-25nt（堿基）的siRNA（short?interferencing?RNA）。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA進一步與體內Argonaute蛋白家族成員結合形成RISC（RNA-induced?silencing?complex)，最后RISC介導siRNA反義鏈與靶mRNA互補結合，切割同源靶mRNA分子，引起同源靶mRNA分子特異性降解。

由于RNAi技術沉默基因的高效性和特異性，人們利用轉基因手段，讓植物表達昆蟲重要基因的dsRNA，dsRNA藉由植食性昆蟲取食進入到昆蟲體內，對靶基因進行RNA干擾，從而抑制昆蟲靶基因的表達，提高了植物的抗蟲性，為培育新一代抗蟲作物帶來契機。

目前，利用RNA干擾技術培育抗蟲轉基因作物，主要通過轉基因手段，使作物表達昆蟲重要基因的dsRNA，籍由昆蟲取食進入消化道，只有dsRNA被昆蟲吸收，dsRNA才能介導內源靶基因沉默，抑制靶基因表達，使昆蟲滯育或死亡。因此，獲得目標害蟲的靶基因，是開展RNA技術防治蟲害研究的基礎。目前面臨的一個主要挑戰就是尋找一個向目標昆蟲體內導入dsRNA簡單而且穩定的方法。顯微注射法是RNAi研究中最廣泛使用的dsRNA導入方法，該方法在蟋蟀G.bimaculatus、擬谷盜Tribolium?castaneum、家蠶Bombyx?mori、甜菜液蛾S.exigua、褐飛虱Nilaparvata?lugens等昆蟲中均取得成功。但顯微注射法篩選昆蟲靶基因最大的障礙就是顯微注射法將昆蟲dsRNA導入昆蟲體內時產生機械損傷，很難確定昆蟲的死亡是由靶基因干擾引起還是顯微注射機械損傷造成，另外干擾效果還受注射體積和注射位置的影響。而將dsRNA加入到昆蟲人工飼料的喂食方法對昆蟲不會造成機械損傷，利用喂食dsRNA方法已經成功地干涉了淺棕蘋果蛾Epiphyas?postvittana,小菜蛾Plutella?xylostella，棉鈴蟲Helicoverpa?armigera等鱗翅目昆蟲靶基因表達。因此，喂食方法是一種潛在的高通量篩選昆蟲靶基因的方法。

然而，現階段利用喂食法篩選大豆食心蟲RNA干擾靶基因的人工飼料及具體方法仍有待改進。

發明內容

本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

發明人發現，制約利用喂食法篩選大豆食心蟲的RNA靶基因方法的主要因素：一是沒有能夠持續大量飼養且能夠讓昆蟲正常生長發育的人工飼料。這是因為，篩選大豆食心蟲靶基因，首先都必須繁殖大量食心蟲。大豆食心蟲是東北大豆產區的主要害蟲，它單食大豆，以初孵幼蟲蛀入莢內為害，大豆食心蟲一年只發生一代，從9月份脫莢入土滯育越冬，直到次年的7月中旬才化蛹羽化成成蟲。在土中棲息達10個月之久。大豆食心蟲幼蟲主要取食豆莢皮內膜和嫩豆粒，大量采集天然飼料受季節的限制，而且天然飼料在離體情況下易變質，飼養難度很大，無法大批量繁殖。目前，有研究者采用黃豆芽飼養初孵幼蟲，然后對一齡以后的幼蟲利用人工飼料進行飼養，但尚無法實現人工飼料持續大量飼養。二是人工飼料里面的RNA酶，會降解加入到人工飼料里面的昆蟲dsRNA，進而降低了通過取食人工飼料進如昆蟲體內的dsRNA量，影響基因干擾對昆蟲生產發育的影響的研究結果，從而影響靶基因篩選的準確性，以及后續利用RNA干擾技術培育抗蟲轉基因作物。