[發明專利]腦炎病毒基因修飾系統的構建及其應用

有效

• 申請號: 201410141195.1
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103898067A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 常國輝;劉京梅;孫走南;韓鵬飛;唐玥;吳曉燕;楊益
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/863;C07K14/18;C12N15/40;A61K39/12;A61K48/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種腦炎病毒（Encephalitis?Virus，EV）基因修飾系統的建立及其突變株應用，特別涉及一種在野生型腦炎病毒XJ-90260株基礎上進行突變后得到的腦炎病毒突變株。

背景技術

腦炎病毒XJ-90260株屬于披膜病毒科甲病毒屬成員。病毒顆粒一般呈球形，直徑60-70nm，具囊膜和微細纖突，核酸為單股正鏈RNA。該病毒可通過蚊蟲叮咬，導致動物和人間疫情的暴發，既是典型的蟲媒傳染病病毒，也是傳統的人獸共患病病毒。感染者大多呈流感樣癥狀，但也有出現嚴重神經癥狀的患者，特別是在兒童，該病有較高的死亡率，給家庭和社會均造成沉重的負擔。

目前，尚未有利用痘苗病毒載體基因修飾技術開展腦炎病毒相關研究的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種腦炎病毒突變株及其應用。

本發明所提供的腦炎病毒突變株，是將野生型腦炎病毒基因組RNA中編碼E1蛋白的第253位氨基酸Phe的密碼子替換為編碼氨基酸Ser的密碼子，且將編碼PE2蛋白中RKRR四肽的核苷酸序列缺失后得到的重組病毒。

在本發明中，所述編碼氨基酸Ser的密碼子具體為AGC。

在本發明中，所述野生型腦炎病毒具體為腦炎病毒XJ90260株。

所述腦炎病毒XJ90260株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列為序列3第45-11489位。

在本發明中，所述腦炎病毒突變株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列具體為序列表中序列2的第45-11477位，即為將所述腦炎病毒XJ90260株的基因組cDNA序列（序列3的第45-11489位）的第10757-10759位的TTT（對應序列3的第10801-10803位）突變為AGC（對應序列2的第10789-10791位），且將第8552-8563位（對應序列3的第8596-8607位）缺失后得到的核苷酸序列。

本發明的另一個目的是提供一種制備所述腦炎病毒突變株的方法。

本發明所提供的制備所述腦炎病毒突變株的方法，具體可包括如下步驟：

（a）將在野生型痘苗病毒基因組DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別克隆至質粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位點位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1細胞后，用步驟（a）獲得的重組質粒甲轉染所述CV-1細胞，所述野生型痘苗病毒與所述重組質粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位點處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；

（c）將步驟（a）中的所述重組質粒甲中的所述gpt基因替換為核苷酸片段A，得到重組質粒乙；所述核苷酸片段A為含有所述腦炎病毒突變株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列的核苷酸片段；

（d）用步驟（b）得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細胞后，用步驟（c）獲得的重組質粒乙轉染所述新的CV-1細胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列發生同源重組，獲得以所述核苷酸片段A替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組痘苗病毒載體丙；

（e）提取步驟（d）得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA；將所述全長RNA轉染BHK-21細胞，培養轉染后的細胞，獲得所述腦炎病毒突變株。

在上述方法中，所述野生型痘苗病毒具體可為野生型痘苗病毒WR株。

進一步，所述野生型痘苗病毒WR株的基因組DNA序列為GenBank號為NC_006998.1的序列。

在上述方法的步驟（a）中，所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點上游和下游的序列分別為GenBank號為NC_006998.1的序列（Up?date：2012-11-22）的第80267-80725位和第80726-81194位（對應序列1的第1-459位和第460-928位）的序列。

在上述方法中，在所述核苷酸片段A中，在所述腦炎病毒突變株的基因組RNA反轉錄的cDNA序列前，含有T7啟動子相關序列；所述T7啟動子相關序列具體可為序列表中序列2（或序列3）的第10-44位。